PPARγ激動劑對成人正常皮膚成纖維細胞轉分化的作用

[摘要]目的:觀察過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動劑對轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導成纖維細胞轉分化的影響，探討其抗瘢痕纖維化的潛在作用。方法:體外培養成人正常皮膚成纖維細胞，利用免疫熒光細胞化學法觀察、分析PPARγ配體15-脫氧前列腺素J2(15d-PGJ2)及其激動劑曲格列酮對TGF-β1誘導的α平滑肌動蛋白(α-SMA)表達的影響，利用Western blot、實時熒光RT-PCR技術檢測PPARγ激動劑對TGF-β1誘導的α-SMA蛋白及mRNA水平的影響。結果:TGF-β1能顯著增加成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞;與TGF-β1誘導組相比，10μM 曲格列酮、15d-PGJ2預處理組的α-SMA表達量顯著減少(P<0.01)，抑制效應分別為31%、57%;預處理組的α-SMA mRNA水平顯著下降 (P<0.01)。結論:PPARγ激動劑能抑制TGF-β1誘導的成人正常皮膚成纖維細胞的轉分化的效應，具有抗皮膚瘢痕化、攣縮的潛在作用。

[關鍵詞]過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ);轉化生長因子β1(TGF-β1);成纖維細胞;肌動蛋白

[中圖分類號]R619+.6Q813.1[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)07-1006-03

Effects of PPARγ agonists on TGF-β1-induced transdifferentiation in normal skin

fibroblasts in vitro

YANG Chong-zhi，ZHANG Hui-tang，WANG Gong-sheng，ZHOU Hai-quan，MA Chi，HU Da-hai

(Department of Burn Surgery， PLA322 Hospital，Datong037006，Shanxi，China)

Abstract: ObjectiveTo observe the effects of peroxisome prolilerator-activated receptor γ (PPARγ) agonists on TGF-β1-induced transdifferentiation of the cultured the normal skin fibroblasts in vitro，so as to explore its effects on inhibiting the formation of hypertrophic scars.MethodsIn cultured normal skin fibroblasts，the effects of both natural (15d-PGJ2) and synthetic (troglitazone) PPARγ agonists on the level of TGF-β1-indued α-smooth muscle actin expression were assessed by immunofluorescence and image analysis.The effects of PPARγ agonists on the level of α-smooth muscle actin expression induced by TGF-β1 were detected by Western blot.ResultsIn normal skin fibroblasts，TGF-β1 enhanced transdifferentiation of fibroblasts to myofibroblasts .The level of α-SMA expression in 15d-PGJ2 and troglitazone-pretreated groupsrespectively were significantly decreased compared with TGF-β1-stimulated group (P<0.01).ConclusionPPARγ agonists may inhibit the profibrotic activities of TGF-β1 on skin fibroblasts:myofibroblast differentiation . Thus PPARγ agonists have novel and potent antifibrotic effects in human skin fibroblasts and may have potential for therapy of hypertrophic scar.

Key words: peroxisome prolilerator-activated receptor γ(PPARγ);ttransforming growth factor-β1;fibroblasts;actins

在增生性瘢痕中存在著大量以α-SMA為細胞標志物的肌成纖維細胞，它在超微結構上兼有成纖維細胞和平滑肌細胞的特征[1]。TGF-β1作為致瘢痕的主要生長因子，可使成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞。TGF-β1在增生性瘢痕中的持續存在及過量表達可增加α-SMA的生成，從而加重瘢痕的增生和攣縮。最近研究表明，臨床上用于治療糖尿病的胰島素增敏劑PPARγ激動劑具有拮抗TGF-β1的上述效應[2-4]。本實驗以正常皮膚成纖維細胞為研究對象，探討PPARγ激動劑干預對TGF-β1誘導成纖維細胞α-SMA效應的影響，從而揭示PPARγ拮抗TGF-β1促瘢痕纖維化、攣縮的作用。

1材料和方法

1.1 主要試劑及儀器:人類重組TGF-β1(Peprotech公司，美國)，15d-PGJ2、曲格列酮(Biomol公司，美國)，鼠抗人α-SMA單克隆抗體、辣根過氧化物酶-山羊抗小鼠IgG (Santa Cruz，美國)，兔抗鼠cy3-IgG(Sigma公司，美國)，IX71型倒置式顯微鏡(Olympus，日本)，TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)，反轉錄反應試劑盒、SYBR Green 熒光定量試劑盒(TaKaRa生物工程公司，日本)，DU800型分光光度計(Beckman Coulter，美國)，Real-Time PCR儀(Bio- Rad公司，美國)。

1.2成纖維細胞培養:取整形手術中切下的多余正常皮膚組織(經患者知情同意)，在無菌條件下漂洗、消毒。原代培養參照文獻[5]組織塊法進行，實驗選用第3～6代細胞。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組:對照組加無血清DMEM培養基，干預組培養基依次為10ng/ml TGF-β1、10μM曲格列酮+10ng/ml TGF-β1、10μM15d-PGJ2+10ng/ml TGF-β1(藥物干預組為兩種藥物分別預處理2h，再加入10ng/ml TGF-β1處理48h)。

1.3.2 免疫熒光細胞化學法觀察α-SMA表達:在6孔培養板內制作細胞爬片，按實驗分組加入培養基進行干預。培養48h后取出細胞爬片，以cy3行免疫熒光染色，以DAPI復染核，其中鼠抗人α-SMA抗體稀釋度為1:200。熒光顯微鏡下觀察，應用美國Media Cybnetics公司的Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件對爬片進行圖像分析。

1.3.3 Western blot檢測α-SMA蛋白表達:將各組細胞裂解液以BCA法進行蛋白定量，取40μg總蛋白以SDS-PAGE分離，半干法電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，以鼠抗人α-SMA單克隆抗體(稀釋比例1:500)作為一抗，4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(稀釋比例1:4000)作為二抗，室溫孵育2h，增強化學發光法顯影。顯影底片經Quantity One圖像分析軟件進行定量分析，以內參β-actin的吸光度(A)值為對照，其余電泳條帶的A值與之相比所得比值表示結果。

1.3.4 實時熒光RT-PCR檢測α-SMA mRNA水平:細胞總RNA提取及mRNA反轉錄參照試劑說明書進行。α-SMA上游引物:5′CAATGTCCCTGCCATGTACGTC 3'，下游引物:5′GGCAGGGCATAG-CCTTCATAGA 3′。反應體系20 μl，含cDNA 5 ng，10 μl SYBR Green混合液，5 μmol/L 的引物1μl。采用Bio-Rad 的IQ5 系統進行SYBR Green 熒光定量PCR 分析，結果采用IQ5 軟件行CT 值相對定量分析，以GAPDH 為內參，每個樣品基因重復3管。

1.4 統計學方法:采用SPSS11.0統計軟件包進行統計學處理，實驗數據以 x±s表示，采用完全隨機設計資料的方差分析行LSD-t檢驗。

2結果

2.1PPARγ激動劑對TGF-β1誘導的肌成纖維細胞轉分化的影響:免疫熒光染色結果顯示，α-SMA陽性表達為紅色熒光，DAPI復染后細胞核呈藍色熒光(圖1)。以圖像分析技術獲得對照組、TGF-β1誘導組、10μM曲格列酮、15d-PGJ2預處理組的光密度平均值分別為0.101±0.011、0.878±0.029、0.303±0.024、0.195±0.034，統計學分析表明，TGF-β1誘導組的α-SMA陽性表達高于對照組(P<0.01)，而經曲格列酮、15d-PGJ2分別預處理后其α-SMA表達明顯低于TGF-β1誘導組，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 PPARγ激動劑對TGF-β1誘導的α-SMA蛋白表達影響:與空白對照組相比，TGF-β1顯著增加α-SMA表達(P<0.01)。分別加入10μM曲格列酮、10μM 15d-PGJ2預處理2h，再加入10ng/ml TGF-β1作用48h，與TGF-β1處理組相比，α-SMA表達量顯著下降(P<0.01)，其抑制效應分別為31%、57%。15d-PGJ2干預組較曲格列酮干預組表達量明顯減少(P<0.05) (圖2)。

2.3PPARγ激動劑對TGF-β1誘導的α-SMA mRNA水平影響:與對照組相比，TGF-β1誘導組顯著增加α-SMA mRNA水平(P<0.05)。分別加入10μM曲格列酮、15d-PGJ2預處理2h，再加入10ng/ml TGF-β1作用48h后，與TGF-β1誘導組相比，各藥物干預組α-SMA mRNA水平顯著下降(P<0.01) (圖3)。

3討論

研究表明[6-7]，在增生性瘢痕中存在著大量以α-SMA為細胞標志物的肌成纖維細胞，肌成纖維細胞比普通的成纖維細胞具有更強的增殖和分泌膠原的能力，并具有收縮性，其在時間與空間上的分布可影響傷口的收縮、瘢痕的形成。TGF-β1作為致瘢痕的主要生長因子，在增生性瘢痕中的持續存在及過量表達可增加α-SMA的生成，從而加重瘢痕的增生和攣縮。本實驗進一步驗證此結論，經免疫熒光細胞化學法及Western blot檢測顯示，TGF-β1誘導成纖維細胞后，α-SMA表達量均比空白對照組明顯增多(P<0.01)。肌成纖維細胞的數量和功能狀態在很大程度上決定了瘢痕纖維化的速度和程度，因此，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉分化是抗瘢痕纖維化的主要策略之一[6-8]。

PPARγ是一類配體激活的核轉錄因子超家族成員，脂肪酸、花生酸類物質和部分前列腺素如15d-PGJ2(15-deoxy-Δ12，14-prostaglandin J2)是其天然配體，胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥是其人工合成配體[9]。目前，PPARγ在抗器官纖維化方面的有效作用成為新的研究熱點。此類研究集中于抗內臟器官的纖維化，尤以抑制腎小球硬化、肝硬化及肺纖維化研究較多[10-12]，但有關PPARγ激動劑抗皮膚瘢痕化的研究還未見相關文獻報道。本實驗Western blot檢測發現，正常皮膚成纖維細胞經10ng/ml TGF-β1誘導后α-SMA表達明顯升高(P<0.01)，在10μM曲格列酮、15d-PGJ2預處理后α-SMA表達顯著減少(P<0.01)，其抑制效應分別為31%、57%。同時利用實時熒光RT-PCR、免疫熒光細胞化學法檢測細胞內的α-SMA，發現在mRNA水平、蛋白原位表達均有相同的變化趨勢。本研究結果提示，激活的PPARγ可拮抗TGF-β1誘導的成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉分化，降低α-SMA的表達，PPARγ此效應的發現豐富了瘢痕增生攣縮的信號分子調控理論。

綜上所述，本實驗結果顯示，PPARγ激動劑可有力拮抗TGF-β1誘導成人正常皮膚成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞。提示PPARγ激動劑在抗皮膚病理性瘢痕方面具有潛在的應用前景，可能會成為臨床上防治病理性瘢痕的新途徑。

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[收稿日期]2010-04-06 [修回日期]2010-06-18

編輯/張惠娟