生物酶連續消化法對犬頸總動脈脫細胞基質材料生物力學的影響研究

[摘要]目的:探討利用生物酶連續消化法制備犬頸總動脈脫細胞血管基質時對材料生物力學的影響。方法:利用胰酶和核酸酶連續消化法制備犬頸總動脈脫細胞血管基質材料，通過組織學、掃描電鏡觀察和DNA含量的檢測，判斷細胞的脫除情況;檢測脫細胞材料的拉伸強度、爆裂強度及順應性，判斷脫細胞過程對材料生物力學性質的影響。結果:組織學染色及掃描電鏡的結果表明血管細胞成分被完全去除，血管細胞外基質成分保留完整;與新鮮犬頸總動脈相比，脫細胞材料的拉伸強度和爆裂強度沒有明顯的改變，而材料的順應性有所降低。結論:生物酶連續消化法制備的犬頸總動脈脫細胞基質材料保持了與新鮮血管大部分生物力學性質，但材料的順應性有所降低。

[關鍵詞]血管;組織工程;細胞外基質;生物力學

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)07-0996-04

Effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical properties of the canine carotid artery

LIU Guo-feng1，HE Zhi-juan2，YANG Da-ping1，XU Xue-wu1，LIU Ying1，REN Li-hong1，LI Qing-chun1

(1.Department of Plastic Surgery，Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology，First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 15001 0，Heilongjiang，China)

Abstract:ObjectiveThe objective of this study is to investigate the effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical and structural properties of the canine carotid artery.MethodsIntact canine carotid artery were decellularized by using Trypsin/EDTA，ribonuclease and desoxyribonuclease. Residual cellular and extracellular matrix composition was evaluated with hematoxylin and eosin (HE) staining，quantitative DNA analysis and scanning electron microscopy. Tensile strength， burst strength and compliance were measured in vitro to determine the effects of decellularizedprocess on the biomechanical properties of the canine carotid artery.ResultsHistology and scanning electron microscopy examination demonstrate that scaffolds were completely decellularized and scaffolds revealed a well-preserved extracellular matrix. Compared with fresh canine carotid artery， decellularized artery had similar burst and breaking strength and had lower compliance.Conclusion This study demonstrates that the decellularized artery using biotic enzymes had similar burst and breaking strength and had lower compliance compared with fresh canine carotid artery.

Key words: vascular grafts; tissue engineering; extracellular matrix; biomechanical

血管組織工程學研究為臨床上小口徑血管移植物的制備提供了光明的前景，口徑小于6mm的小口徑組織工程血管研究與大口徑血管移植物的研究有很大的差別[1]。因為血管移植物與受區血管生物力學性質的匹配程度對不同口徑的組織工程血管移植物通暢率的影響差別較大，血管移植物的口徑越小受到的影響越大，小口徑血管移植物在受體內更容易發生內膜增生、中膜增厚，最后導致移植物的官腔狹窄甚至閉塞[2]。血管組織工程研究中支架材料的力學性質對血管移植物的生物力學性質起著決定性的作用，所以在小口徑組織工程工程血管的研究中制備與受區血管生物力學性質完全匹配的支架材料是最關鍵的科學問題，這將決定小口徑組織工程血管移植的遠期通暢率[3]。本實驗將對小口徑組織工程血管脫細胞基質生物支架材料的生物力學性質進行研究，明確生物酶聯合消化法對犬頸總動脈脫細胞基質材料生物力學的影響。

1材料和方法

1.1 實驗用動物:普通雜種家犬，體重25～30kg，6個月齡，雌雄不限。

1.2 實驗材料及主要儀器:胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)、脫氧核糖核酸酶(Desoxyribonu clease，DNase):美國Sigma公司;EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer solution，PBS):北京中杉生物公司;普通光學顯微鏡:日本Nikon公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡:日本Hitachi公司;電子萬能實驗材料機:德國Zwick-Roell公司。

1.3 犬頸總動脈脫細胞基質材料制備: 無菌條件下切取犬頸總動脈，大量無菌PBS沖洗，去除血液成分及外層附屬軟組織，選擇切取長度約為7cm，內徑約為3mm的動脈，利用胰蛋白酶和核酸酶連續消化法去除動脈細胞及其碎片成分[4]。先用0.1% 胰蛋白酶加0.02% EDTA 溶液消化20h，中間更換1次消化液，大量PBS沖洗后用20μg/ml RNase +200μg/ml DNase溶液消化2h，大量無菌PBS 溶液沖洗。以上步驟均在5%CO2、37℃，80次/ min持續震蕩條件下進行。監測制備的脫細胞血管基質，使材料的細胞DNA殘留量少于0.1%。同時選取新鮮犬頸總動脈作為對照組(每組6例)，進行以下檢測。

1.3 組織學染色 將標本置于10%中性甲醛溶液中固定24h，常規石蠟包埋、切片，進行HE染色。在普通光學顯微鏡下對標本的結構進行組織學評價照相。

1.4 掃描電鏡觀察 將標本在1%戊二醛溶液中固定24h以上，用1%餓酸作后固定2h，50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水，50%、70%、90%、100%醋酸異戊酷置換，應用臨界點干燥儀、液體C02等進行干燥;干燥的標本固定在鋁質標本臺上，用濺射鍍膜機鍍金后，用S-3400N型掃描電子顯微鏡系統觀察并照相。

1.5 生物力學檢測:利用Zwick/Roell Z010型電子萬能力學實驗機測定標本的拉伸強度、爆裂強度及軸向順應性。拉伸強度及軸向順應性檢測:將管狀標本(長度為5cm)兩端固定于微型夾具上，以0.5mm/s的速度拉伸，直至標本斷裂，系統自動記錄標本的應力-應變曲線及極限拉伸強度，計算出標本的軸向順應性。爆裂強度檢測:把管狀標本一端用絲線結扎，另一端固定于裝滿生理鹽水的5ml醫用注射器上，注射器筒壁固定于250ml玻璃葡萄糖瓶中，整個裝置平置在力學實驗機上，以40kPa/s的力向標本內注射生理鹽水，直至標本爆裂或漏液，系統自動記錄標本的爆裂強度。

1.6統計學分析: 所有定量實驗結果均用x±s表示，利用SPSS11.0統計學軟行獨立樣本t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2結果

2.1大體所見:犬頸總動脈脫細胞基質材料仍保持新鮮血管的管狀結構，血管的長度及內徑無明顯改變，材料外觀呈乳白色(圖1)。

2.2 組織學結構:新鮮犬頸總動脈具有血管典型的三層結構:內膜、中膜及外膜，中膜層較厚，包含大量的環狀排列藍染的細胞核成分和細胞外基質成分(圖2A)。經脫細胞處理后，血管壁中的藍染的細胞核成分全部去除，但脫細胞血管的細胞外基質中纖維成分保存完整連續，沒有發生斷裂破碎等。血管的中膜層結構中可見細胞及部分細胞外基質去除后遺留的空隙，同時血管內外膜結構的細胞外基質成分保持完好(圖2B)。

2.3 掃描電鏡觀察:脫細胞犬頸總動脈脫細胞基質橫斷面的掃描電鏡照片可見大致的三層細胞外基質結構，內層見完整致密的內彈性膜，中層可見成層環狀排列的纖維板層結構，纖維連續，可見梭形空隙，材料外層可見雜亂排列的外膜層纖維條索組織(圖3A)。材料內表面掃描電鏡照片顯示，材料的內彈性膜纖細的纖維呈網狀分布，纖維完整，未見明顯斷裂缺失，透過纖維網可見深部中膜層較粗大的纖維(圖3B)。

2.4 生物力學性質:爆裂強度檢測結果如下，脫細胞犬頸總動脈基質組為315.00±12.49 KPa，新鮮犬頸總動脈組為330.52±18.73 KPa，兩組標本爆裂強度相似，差別無統計學意義(P>0.05)(圖4)。極限拉伸強度檢測結果如下:脫細胞犬頸總動脈基質組為4 122.91±118.05 KPa，新鮮犬頸總動脈組為4 212.99±103.80 KPa，兩組標本極限拉伸強度相似，差別無統計學意義(P>0.05)。軸向順應性計算結果如下，脫細胞犬頸總動脈基質組為0.945±0.158 mm/mm，新鮮犬頸總動脈組為1.195±0.22 mm/mm，脫細胞犬頸總動脈基質組軸向順應性低于新鮮犬頸總動脈組，差別有統計學意義(P<0.05)(圖5)。

3討論

具有三維空間結構的支架材料是構建組織工程血管的基本要素之一，能為血管種子細胞生長和組織發育提供臨時的支撐骨架，并能夠調控所構建血管的形態。研制和開發理想的支架材料仍然是血管組織工程所面臨的巨大挑戰。為了克服可降解高分子聚合物材料在生物相容性方面的不足，很多學者把研究目光轉移到了自然來源的生物支架材料上[5]。自然生物材料具有良好的生物相容性，能夠促進細胞的黏附、生長、增殖及生物功能的發揮。血管組織工程支架材料的發展趨勢是自然生物材料的應用，自然生物材料是最有應用潛力的組織工程支架材料來源[6]。血管脫細胞基質材料的三維空間結構與自然血管的結構非常類似，因此具有理想的外形和適當的生物力學性質，是血管組織工程學研究中較為理想的生物支架材料[7]。

正常血管的細胞外基質成分包含膠原纖維、彈性蛋白及蛋白聚糖等成分，膠原纖維及彈性蛋白對于血管的強度起關鍵性的作用。膠原纖維具有良好的抗張強度，對于維持血管的完整性具有重要意義，彈性蛋白和蛋白聚糖有一定的彈性，能夠使血管具有良好的順應性[8]。研究表明，脫細胞處理會改變血管原有的生物力學性質，特別是材料的順應性常會降低[9]。本實驗利用生物酶連續消化法制備的犬頸總動脈脫細胞基質材料在去除了細胞及DNA殘留物的同時，細胞外基質的纖維成分保持完整連續，所以脫細胞材料的拉伸強度和爆裂強度與新鮮血管相似。除膠原纖維和彈性蛋白等細胞外基質纖維成分外，蛋白聚糖成分在脫細胞處理過程中常會遭到破壞，蛋白聚糖的去除對于脫細胞血管的拉伸強度和爆裂強度沒有明顯的影響，但會使材料的彈性降低變硬，生物力學的表現是材料的順應性下降[10]。本實驗的結果也證實了這一點，經過生物酶連續消化脫細胞處理，脫細胞犬頸總動脈基質材料的軸向順應性有所降低，從組織學觀察可以看出，脫細胞后血管橫斷面膠原纖維和彈性蛋白等纖維條索中間出現很多梭形空隙，這些空隙是由于中膜內平滑肌細胞及蛋白聚糖的去除而形成的，因此，脫細胞犬頸總動脈的軸向順應性與新鮮血管相比有所降低。

組織工程血管的拉伸強度、爆裂強度的順應性是重要的生物力學力學評價指標，足夠的拉伸強度和爆裂強度能夠保證血管移植后能夠抵抗長期的血液動力學作用而不形成動脈瘤。而對于小口徑組織工程血管移植物，順應性與拉伸強度和爆裂強度相比顯得更為重要，小口徑血管移植物和受區血管之間的順應性要匹配，這是移植物長期成功的重要保證[11-12]。血管移植物與受區血管之間的順應性等力學性質錯配會導致血流動力學的變化，血流方向改變、剪切力增加、下游血流紊亂、循環張力改變，從而引起吻合口處的應力集中，刺激內膜增生的生長因子的釋放增加，促進了血栓的形成和新內膜的增生，最終導致血管移植物長期通暢率明顯降低[13-14]。脫細胞處理經常會導致血管細胞外基質材料順應性的降低，從而影響構建的小口徑組織工程血管與受區血管生物力學性質的匹配，導致移植失敗，所以提高以脫細胞血管基質為支架材料的小口徑組織工程血管的順應性是組織工程血管研究的瓶頸問題。可能的解決方案包括:(1)改進完善脫細胞血管基質材料的制備方法，在保證血管細胞成分完全去除的前提下盡量保留細胞外基質材料原有的生物力學性質;(2)通過在脫細胞血管基質材料上復合某種其他材料制備順應性良好的復合支架材料;(3)在體外利用脫細胞血管支架材料構建組織工程血管的過程中促使平滑肌細胞分泌大量新生細胞外基質成分，以增加組織工程血管的順應性。

[參考文獻]

[1]Isenberg BC，Williams C，Tranquillo RT.Small-diameter artificial arteries engineered in vitro[J]. Circ Res，2006，98(1):25-35.

[2]Wang X，Lin P，Yao Q，et al. Development of small-diameter vascular grafts[J]. World J Surg，2007，31(4):682-689.

[3]Tiwari A，Cheng KS，Salacinski H，et al. Improving the patency of vascular bypass grafts: the role of suture materials and surgical techniques on reducing anastomotic compliance mismatch[J]. Eur J Vasc Endovasc Surg，2003，25(4):287-295.

[4]劉國鋒，楊大平，郭鐵芳，等. 小口徑組織工程血管脫細胞生物支架材料的研究[J]. 中國康復理論與實踐，2008，14(3): 234-236，301.

[5]Stegemann JP，Kaszuba SN，Rowe SL. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials[J]. Tissue Eng，2007，13(11):2601-2613.

[6]Meredith JE Jr，Fazeli B，Schwartz MA. The extracellular matrix as a cell survival factor[J]. Mol Biol Cell，1993，4(9): 953-961.

[7]Schmidt CE，Baier JM. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering[J]. Biomaterials，2000，21(22):2215-2231.

[8]MacNeill BD，Pomerantseva I，Lowe HC，et al. Toward a new blood vessel[J]. Vasc Med，2002，7(3):241-246.

[9]Amiel GE， Komura M，Shapira O，et al. Engineering of blood vessels from acellular collagen matrices coated with human endothelial cells[J]. Tissue Eng，2006，12(8):2355-2365.

[10]Courtman DW， Pereira CA， Kashef V. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: biochemical and mechanical effects of cell extraction[J]. J Biomed Mater Res，1994，28:655-666.

[11]Ballyk PD， Walsh C， Butany J，et al. Compliance mismatch may promote graft-artery intimal hyperplasia by altering suture-line stresses[J]. J Biomech， 1998，31(3):229-237.

[12]Abbott WM， Megerman J，Hasson JE，et al. Effect of compliance mismatch on vascular graft patency[J]. J Vasc Surg，1987，5(2):376-382.

[13]Howard AB，Alexander RW，Nerem RM，et al. Cyclic strain induces an oxidative stress in endothelial cells[J]. Am J Physiol，1997，272(2 Pt 1):C421-427.

[14]Trubel W，Moritz A，Schima H，et al. Compliance and formation of distal anastomotic intimal hyperplasia in Dacron mesh tube constricted veins used as arterial bypass grafts[J]. Asaio J，1994，40(3):M273-278.

[收稿日期]2010-05-25[修回日期]2010-07-10

編輯/張惠娟