脂肪來源干細胞在脂肪移植中的作用及其臨床應(yīng)用進展

長期以來，對于各種原發(fā)的和繼發(fā)的軟組織缺損的治療一直是困擾整形外科醫(yī)生的難題之一。自體脂肪作為一種軟組織填充物，由于其諸多的并發(fā)癥曾一度被人們放棄，但隨著組織工程技術(shù)及細胞生物學(xué)的不斷發(fā)展，自體脂肪移植又逐漸被人們認(rèn)可?，F(xiàn)將脂肪干細胞在脂肪移植中的作用及其臨床應(yīng)用現(xiàn)狀綜述如下。

1脂肪移植的發(fā)展概況

20世紀(jì)初，自體顆粒脂肪移植開始應(yīng)用于臨床，由于其吸收率高、存活率低，且并發(fā)癥較多，限制了其在臨床中的應(yīng)用。21世紀(jì)初，通過改進脂肪獲取技術(shù)，加速了脂肪血管化，提高了脂肪顆粒移植的成活率。但是壞死、吸收仍然是顆粒脂肪移植的主要并發(fā)癥。1998年，Coleman發(fā)明了結(jié)構(gòu)脂肪(liposuction)移植技術(shù)，即在脂肪移植的整個過程中保證脂肪細胞具有更多的完整性和活性，也就是后來所說的Coleman技術(shù)，使脂肪移植的存活率有了很大的提高。而自Zuk等[1]首次從自體脂肪組織中分離獲得具有多向分化潛能的細胞—脂肪來源干細胞(Adipose-derived stem cells，ASCs)以來，其研究越來越深入，因為其來源豐富，取材方便，且組織中干細胞含量豐富，因而ASC被認(rèn)為是組織再生和修復(fù)的理想細胞來源，可為多種疾病的治療提供充足的種子細胞[2]。近年來，隨著組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為克服常規(guī)注射顆粒脂肪移植的問題，如吸收、囊腫、硬結(jié)等，Yoshimura等[4]又發(fā)明了細胞輔助的脂肪移植術(shù)(cell-assisted lipotransfer，CAL)，為脂肪移植提供了一種更為可靠的方法。該技術(shù)是將自體脂肪來源干細胞(Adipose-derived stem cells，ASCs)與脂肪細胞混合，聯(lián)合注射移植。

2脂肪移植中的細胞基礎(chǔ)

脂肪組織通常被認(rèn)為是貯存能量及內(nèi)分泌器官，是軟組織填充和吸脂處理的必要組織。同時還被認(rèn)為是成體干細胞的有效來源，因為脂肪組織含有多種的祖細胞，可分化為多種譜系[3]。脂肪組織中主要包含脂肪細胞、ASCs、血管內(nèi)皮細胞、壁細胞、成纖維細胞、巨噬細胞及細胞外基質(zhì)等[4]，其中脂肪細胞和ASCs是近年來研究的熱點。脂肪細胞是脂肪組織的基礎(chǔ)，其體積占總體積的90%以上，但數(shù)量卻少于50%[5-6]。ASCs被認(rèn)為是一種表現(xiàn)脂肪細胞和血管細胞的祖細胞[7]，它位于脂肪細胞之間、血管周圍或細胞外基質(zhì)中，可促進脂肪組織的轉(zhuǎn)歸[8]。但脂肪組織的轉(zhuǎn)歸是一個很漫長的過程，成年人平均每年大約有10%左右的脂肪細胞被更新[8-9]，而ASCs又存在于脂肪組織的間質(zhì)血管碎片中(stromal vascular fraction，SVF)[10]。間質(zhì)血管碎片(SVF)是干細胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多種細胞混合物形成的細胞團就叫做間質(zhì)血管碎片(SVF)。間質(zhì)血管碎片中含有豐富的間充質(zhì)細胞，可分化為多種譜系的細胞，是再生醫(yī)學(xué)、組織工程等最理想的種子細胞。獲取SVF的方法主要是[5]將吸脂后的脂肪用PBS (phosphate-buffered saline)反復(fù)沖洗兩次，然后在37℃條件下用0.075%的膠原酶消化30min，再用含10%胎牛血清的DMEM終止消化，1200g離心10min后就會獲得高密度的SVF碎片[1]。其中主要包括間質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和壁細胞。另外， SVF中也包括一些血管來源的細胞，如白細胞和紅細胞等，而血管來源細胞的比率主要取決于個體出血的多少。在CAL中，不需經(jīng)過人工的分選及培養(yǎng)，直接將分離的新鮮的自體SVF用來做脂肪移植補充物[11-12]。另外，有研究指出新鮮分離的脂肪干細胞與培養(yǎng)增殖的干細胞相比可能在治療方面更具有安全性和有效性[4，13]。現(xiàn)在正在進行的一些臨床試驗也經(jīng)常應(yīng)用新鮮分離的SVF，而不是純化或培養(yǎng)的ASCs。因為SVF包含其他細胞，如血管內(nèi)皮細胞或巨噬細胞等，許多研究發(fā)現(xiàn)它們之間有一種協(xié)同效應(yīng)[14-16]。

3ASCs在脂肪移植中的作用

脂肪移植后脂肪組織的存活和萎縮的機制并未得到證明。移植后無微血管的脂肪組織被安置于異位組織中—相對缺血區(qū)，最初幾天的營養(yǎng)灌注來自于宿主組織周圍組織，直到形成新的微血管。對于損傷的反應(yīng)，損傷的宿主組織，特別是細胞外基質(zhì)和死亡的細胞會釋放FGF[16]。在修復(fù)過程中，脂肪細胞(對缺氧很敏感)在氧壓低于其閾值的情況下24h內(nèi)可能死亡。但是ASCs更能耐受缺氧，其在缺氧情況下可保持功能72h[17]。在動物模型的缺血再灌注損傷的脂肪組織中，ASCs在脂肪移植的修復(fù)過程中及在脂肪化和血管化中起著重要的作用[18]，其可調(diào)節(jié)周圍組織中生長激素及細胞因子的釋放[19]，并通過分泌各種生長因子如VEGF，IGF-1防止細胞凋亡[20]，使脂肪組織的再生和凋亡達到平衡。

ASCs存在于脂肪細胞之間、血管壁、結(jié)締組織中，但大部分聚集在血管周圍。其在缺氧條件下可釋放血管形成因子[21-22]，并可分化為血管內(nèi)皮細胞[23-24]，表現(xiàn)為成血管特性，成為治療局部缺血性疾病血管發(fā)生的最理想細胞來源。一些研究表明存在血管壁的細胞群落可分化為血管[25-26]。最近發(fā)現(xiàn)大鼠的脂肪祖細胞像血管管壁細胞一樣存在于脂肪組織的血管中[27]。因此，ASCs被認(rèn)為是一種脂肪細胞和血管細胞的雙重祖細胞。ASCs可為脂肪組織的轉(zhuǎn)歸和下一代的再生提供原始細胞，脂肪組織細胞凋亡后可被ASCs來源的下一代細胞取代[6-7]。脂肪組織會隨著發(fā)育、肥胖而增殖，也會隨著老齡化、缺血而發(fā)生萎縮，還可在損傷后修復(fù)、缺血再灌注的損傷及脂肪移植后起到塑形作用。發(fā)生這些塑形過程可能是因為脂肪細胞的凋亡壞死和ASCs引起的脂肪化之間的失衡，在這些變化過程中同時也伴隨著微血管的重塑。同時，Caplan[28]也指出脂肪組織隨著年齡的增長而萎縮可能由于ASCs的減少，凋亡和再生失去了平衡。一些前期的研究還發(fā)現(xiàn)即使存活的脂肪細胞在移植的最初幾個月內(nèi)也會發(fā)生死亡并被下一代細胞所取代，其原因可能由于局部缺血。因此，有功能的ASCs的數(shù)量可能在組織修復(fù)和塑形中具有重要作用。

4ASCs在細胞輔助的脂肪移植術(shù)(CAL)中的作用

CAL技術(shù)是將新抽取脂肪分成兩份:一份用來提取SVF，另一份作為提取的細胞外基質(zhì)，兩部分聯(lián)合注射于受區(qū)[12]。Sterodimas[10]指出吸脂的脂肪組織與完整脂肪組織相比， ASCs的數(shù)量只有原來的一半。其原因可能是因為一部分ASCs停留在大血管周圍或留在受體組織中，一部分ASCs釋放入吸脂脂肪的液體成分中[12]。這種低ASCs比率可能是移植的脂肪組織長時間后萎縮的主要原因。最近的研究表明[10，29-30]脂肪來源干細胞輔助治療可提高存活脂肪組織的體積和質(zhì)地。在CAL中[31-32]，脂肪組織可作為有活力的生物支架，使新鮮的包含ASCs的SVF粘附于脂肪組織上，不僅增加了前體細胞的數(shù)量，還有利于組織血管的形成和ASCs向脂肪組織的轉(zhuǎn)歸，提高了脂肪組織的成活率。Yoshimura[32]認(rèn)為ASCs在CAL中的作用可能是:①分化成脂肪細胞并促進脂肪再生;②分化成血管內(nèi)皮細胞和壁細胞，以促進血管化作用;③在缺氧、損傷等條件下可促進血管生長因子釋放，如肝細胞生長因子(HGF)， 基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1);④最有可能的就是ASCs作為原始的ASCs而成活。

5ASCs的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

Ogawa[33]指出干細胞在臨床上的應(yīng)用應(yīng)考慮三方面的因素:①如何在無損傷的條件下獲取、處理及增殖細胞，操作的簡單性及高效性等;②如何使干細胞分化成所需細胞及如何建立起有效的三維組織結(jié)構(gòu);③如何保證分化后細胞的存活及組織的再生，因為組織再生必須具有一定的脈管系統(tǒng)來保證組織和分化后細胞的存活。而脂肪來源干細胞可分化為內(nèi)皮細胞和脂肪細胞，促進血管和脂肪組織的形成，并且來源豐富、操作簡單，可滿足軟組織填充的基本要求。臨床前研究及早期的臨床研究也指出ASCs復(fù)合可注射型支架材料可作為軟組織填充物應(yīng)用于整形外科中[30]。目前，歐洲和亞洲已有許多國家已經(jīng)開始利用人類ASCs構(gòu)建組織工程脂肪組織，用于修復(fù)軟組織的缺損。

Yoshimura[32]是首位將ASCs的臨床經(jīng)驗公布的作者，2003～2008年，Yoshimura 等[34]利用細胞輔助的吸脂術(shù)進行了臨床研究，共做了307例患者(女性303例、男性4例)，乳房手術(shù)269例(177例隆胸術(shù)，52例乳房植入物替代術(shù)和40例乳房切除術(shù)后再造)面部手術(shù)48例(3例紅斑狼瘡，2例Romberg病和1例硬皮病)，臀部4例，手部3例。結(jié)果顯示患者對移植后皮膚的自然紋理、柔軟度、軟組織填充后的塑形等都很滿意。3D檢測顯示隆胸后移植物存活率在40%～80%[31]，CT及MRI顯示脂肪組織存活很好，在乳房腺體周圍及腺體和胸肌之間形成了一定厚度的脂肪層。在面部脂肪萎縮的治療中，其有效性得到了充分的證實，另外，CAL在治療半側(cè)顏面萎縮及深部紅斑狼瘡中也有明顯的效果[34]。但是在臨床試驗中，有2例患者注射SVF后3個月發(fā)生了異位的纖維組織形成，CT顯示皮下脂肪層中有纖維組織形成。這種結(jié)果可能由于微環(huán)境的變化使ASCs產(chǎn)生了非必要的細胞分化，Yoshimura [35]指出為了避免這種情況，ASCs盡量與脂肪組織充分粘附，使其向必需細胞方向轉(zhuǎn)化。在臨床上，ASCs也被應(yīng)用于治療其他疾病，如急性心肌梗死、周圍血管疾病、軟組織及骨骼的缺損、皮膚損傷等，結(jié)果表明都有很好的治療效果[38]。CAL也被應(yīng)用于放療后并發(fā)癥的治療，臨床結(jié)果顯示所有患者的癥狀都有明顯的改善，其原因可能是由于組織血管的形成和器官功能的恢復(fù)[37]。

綜上所述，新鮮分離的SVF含有豐富的脂肪來源干細胞，血管內(nèi)皮細胞等前體細胞。在CAL中它與其他細胞相互影響并通過自分泌，分泌多種促血管化的細胞因子，可增加組織的血管化程度，改善移植物的質(zhì)地，極大地提高了脂肪移植的存活率。雖然自體脂肪移植的安全性和長期有效性等有待進一步的評估，其作用機制也有待進一步的研究，但筆者相信由于SVF復(fù)合自體脂肪移植獨特的優(yōu)越性，其必將在整形美容外科領(lǐng)域成為一種理想的軟組織填充物。

[參考文獻]

[1]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage Cells from Human Adipose Tissue:Implications for Cell-Based Therapies[J].Tissue Eng，2001，7(2):211-226.

[2]Gimble JM，Katz AJ， Bunnell BA.Adipose-derived stem cells for regenerative medicine[J].Circ Res，2007，100(9):1249-1260.

[3]Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell，2002，13(12):4279-4295.

[4]Yoshimura K，Shigeura T，Matsumoto D，et al.Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates[J].J Cell Physiol，2006，208(1):64-76.

[5]Suga H，Matsumoto D，Inoue K，et al.Numerical measurement of viable and nonviable adipocytes and other cellular components in aspirated fat tissue[J].Plast Reconstr Surg，2008，122(1):103-114.

[6]Trayhurn P，Wang B，Wood IS.Hypoxia in adipose tissue: a basis for the dysregulation of tissue function in obesity[J]? Br J Nutr，2008，100(2):227-235.

[7]Planat-Benard V，Silvestre JS，Cousin B，et al.Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives[J].Circulation，2004，109(5):656-663.

[8]Spalding KL，Arner E，Westermark PO，et al.Dynamics of fat cell turnover in humans[J].Nature，2008，453(7196):783-787.

[9]Strawford A，Antelo F，Christiansen M，et al.Adipose tissue triglyceride turnover， de novo lipogenesis， and cell proliferation in humans measured with 2H2O[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2004，286(4):E577-E588.

[10]Sterodimas A，de Faria J，Nicaretta B，et al.Cell-Assisted Lipotransfer[J].Aesthet Surg J，2010，30(1):78- 82.

[11]Matsumoto D，Sato K，Gonda K，et al.Cell-assisted lipotransfer:supportive use of human adipose-derived cells for soft tissue augmentation with lipoinjection[J].Tissue Eng，2006，12(12):3375-3382.

[12]Yoshimura K，Sato K，Aoi N，et al.Cell-assisted lipotransfer(CAL)for cosmetic breast augmentation:suppor-tive use of adipose-derived stem/stromal cells[J].Aesthetic Plast Surg，2008，32(1):48-55.

[13]Varma MJ，Breuls RG，Schouten TE，et al.Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells[J].Stem Cells Dev，2007，16(1):91-104.

[14]Borges J，Müller MC，Momeni A，et al.In vitro analysis of the interactions between preadipocytes and endothelial cells in a 3D fibrin matrix. Minim[J].Invasive TherAllied Technol，2007，16(3):141-148.

[15]Rajashekhar G，Traktuev DO，Roell WC，et al.IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communicateon:role of canonical Wnt signaling[J].Stem Cells，2008，26(10):2674-2681.

[16]Muthukrishnan L，Warder E，McNeil PL.Basic fibroblast growth factor is efficiently released from a cytolsolic storage site through plasma membrane disruptions of endothelial cells[J].J Cell Physiol，1991，148(1):1-16.

[17]Myolotte LA，Duffy AM，Murphy M，et al.Metabolic flexibility permits mesenchymal stem cell survival in an ischemic environment[J].Stem Cells，2008，26(5):1325-1336.

[18]Suga H，Eto H，Shigeura T，et al.IFATS collection: FGF-2-induced HGF secretion by adipose-derived stromal cells inhibits post-injury fibrogenesis through a JNK- dependent mechanism[J].Stem Cells，2009，27(1):238-249. [19]Uysal AC，Mizuno H，Tobita M，et al.The Effect of Adipose-Derived Stem Cells on Ischemia-Reperfusion Injury: Immunohistochemical and Ultrastructural Evaluation[J].Plast Reconstr Surg，2009，124:804-815.

[20]Zhu M，Zhou ZY，Chen Y，et al.Supplementation of Fat Grafts With Adipose-Derived Regenerative Cells Improves Long-Term Graft Retention[J].Ann Plast Surg，2010，64:222-228.

[21]Rehman J，Traktuev D，Li J，et al.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells[J].Circulation，2004，109(10):1292-1298.

[22]Thangarajah H，Vial IN，Chang E，et al.IFATS collection: Adipose stromal cells adopt a proangiogenic phenotype under the influence of hypoxia[J].Stem Cells，2009，27(1):266-274.

[23]Cao Y，Sun Z，Liao L，et al.Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，332(2):370-379.

[24]Moon MH，Kim SY，Kim YJ，et al.Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia[J].Cell Physiol Biochem，2006，17(5-6):279-290.

[25]Alessandri G，Girelli M，Taccagni G，et al.Human vasculogenesis ex vivo:embryonal aorta as a tool for isolation of endothelial cell progenitors[J].Lab Invest，2001，81(6):875-885.

[26]Zengin E，Chalajour F，Gehling UM，et al.Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis[J].Development，2006，133(8):1543-1551.

[27]Tang W，Zeve D，Suh JM，et al.White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature[J].Science， 2008，322(5901):583-586.

[28]Caplan AI.Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine[J].J Cell Physiol，2007，213(2):341-347.

[29]Masuda T，F(xiàn)urue M，Matsuda T.Novel strategy for soft tissue augmentation based on transplantation of fragmented omentum and preadipocytes[J].Tissue Eng，2004，10(11-12):1672-1683.

[30]Moseley TA，Zhu M，Hedrick MH.Adipose-derived stem and progenitor cells as fillers in plastic and reconstructive surgery[J].Plast Reconstr Surg，2006，118(Supply3):S121-S128.

[31]Yoshimura K，Asano Y，Aoi N，et al.Progenitor-enriched adipose tissue transplantation as rescue for breast implant complications[J].Breast J，2010，16(2):169-175.

[32]Yoshimura K，Suga H，Eto H.Adipose-derived stem/progenitor cells:roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation[J].Regen Med，2009，4(2):265-273.

[33]Rei Ogawa.The Importance of Adipose-Derived Stem Cells and Vascularized Tissue Regeneration in the Field of Tissue Transplantation[J].Current Stem Cell Research Therapy，2006，1:13-20.

[34]Yoshimura K，Sato K，Aoi N，et al.Cell-assisted lipotransfer for facial lipoatrophy: efficacy of clinical use of adipose-derived stem cells[J].Dermatol Surg，2008，34:1178 -1185.

[35]Yoshimura K，Aoi N，Suga H，et al.Ectopic fibrogenesis induced by transplantation of adipose-derived progenitor cell suspension immediately after lipoinjection[J].Transplantation，2008，85(12):1868-1869.

[36]Hong SJ，Traktuev DO，March KL.Therapeutic potential of adipose-derived stem cells in vascular growth and tissue repair[J].Current Opinion in Organ Transplantation，2010，15:86-91.

[37]Rigotti G，Marchi A，Galiè M，et al.Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant:a healing process mediated by adipose-derived adult stem cells[J].Plast Reconstr Surg，2007，119:1409-1422.

[收稿日期]2010-05-09[修回日期]2010-06-30

編輯/李陽利