胎兒頭皮毛囊內黑素細胞HMB-45和NKI/beteb的表達

[摘要]目的:觀察黑素細胞在胎兒頭皮內的定位。方法:獲取胎兒頭皮(胎齡7月，畸形引產，死亡2h)，制備冰凍切片，分別用HMB-45和NKI/beteb抗體進行免疫熒光染色和免疫組化染色，激光共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡觀察攝片。結果:NKI/beteb陽性細胞主要位于胎兒頭皮的毛囊外根鞘隆突區，也見于毛球處、表皮基底部。HMB-45陽性細胞主要存在于毛球部、毛母質和表皮基底部，外根鞘區表達則陰性。結論:胎兒頭皮毛囊內存在不同狀態的黑素細胞，位于毛囊外根鞘隆突區的黑素細胞是黑素母細胞。

[關鍵詞]毛囊;胎兒;隆突;黑素細胞

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)07-1003-04

Location of melanocytes in hair follicle of fetal scalp

LI Hong-zhou，XUE Dong-zhang，ZHANG Ru-zhi，ZHU Wen-yuan，ZHANG Jing，CHEN Ze-nong，ZHAO Hao

(1. Department of Dermatology，First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University， Hefei 233004，Anhui，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the location of melanocytes in hair follicle of fetal scalp. MethodsThe scalp was from a died fetus (fetal age of 7 months， induction delivery due to developmental abnormity ) and prepared for frozen sections， thenwhich respectively received immunofluorescent and immunofluochemical staining with HMB-45 and NKI/beteb antibodies. The stain results was observed and photographed by confocal microscope and the inverted microscope， respectively. ResultsThe positive cells stained by NKI/beteb antibody were mainly located at the bulge regions in the outer root sheath (ORS) of hair follicle， some in the hair bulbs and the epidermal basilar parts. The HMB-45 positive cells were present in the hair bulb， the hair matrix and the epidermal basilar parts， but not in ORS.ConclusionThere are melanocytes with different status in hair follicle. Melanocyte at the bulges of ORS is melanoblast.

Key words:hair follicle; fetus; bulge; melabocyte

毛囊是一個獨特的皮膚附屬器， 其色素單位的自我更新取決于毛囊內的黑素干細胞(melanocyte stem cells， MSCs)及其子代細胞。毛囊MSCs特征如下:具備不成熟、慢循環、自我修復、產生子代細胞，并且活化增殖毛發生長早期的細胞。毛囊黑素干細胞 (follicle melanocyte stem cells，FMSC)是MSCs中的一種。有報道鼠毛囊外隆突區檢測出MSCs[1]。鼠的胚胎研究顯示，FMSC存在于毛囊永久性區域的下部毛囊隆突區，具有MSCs的特征，受刺激后可以分化成為成熟的黑色素細胞[2]。因此，筆者設計此實驗初步定位人胎兒的FMC，觀察HMB45，NKI/beteb在人類胎兒毛囊中的表達情況。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源:引產胎兒的頭皮(胎齡7月，畸形引產)，取標本時，胎兒已死亡2h。

1.1.2主要儀器及試劑:小鼠抗人HMB-45單克隆抗體(北京中山生物技術公司);小鼠抗人NKI/beteb單克隆抗體(Abcam);DyLightTM488標記山羊抗小鼠IgG(北京中山生物技術公司)辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(北京中山生物技術公司);OLYPUS倒置顯微鏡;激光共聚焦顯微鏡(NIKON-EZ-C1SI)。

1.2 方法

1.2.1 標本處理:獲取胎兒頭皮，用碘伏浸洗5min后，酒精去碘伏，接著生理鹽水沖洗數次，剪刀修剪組織標本，去除脂肪，筋膜等多余組織，再用生理鹽水沖洗數次，最后多聚甲醛固定組織15min后，制備冰凍切片(4μm)，用冷丙酮固定15min。

1.2.2 共聚焦顯微鏡觀察:TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗組織切片，5min/次，需2次，5%牛血清白蛋白室溫封閉15min。TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗組織片，5min/次，需2次。分別加入一抗小鼠抗人HMB-45(1:100)，NKI/beteb(1:100)單克隆抗體孵育，4℃過夜。TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗組織片3次，5min/次。暗室內加免疫熒光二抗DyLightTM488標記山羊抗小鼠IgG(1:200)，37℃孵育，2h。TBS溶液浸洗組織片3次，5min/次。自然晾干。90%甘油封片。DyLightTM488-TFP熒光素是在Omnichrome氬-氪離子激光器的488nm處激發，515～565nm波段處濾過發射。激光共聚焦顯微鏡下觀察攝片。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察:PBS洗浸洗組織切片，0.3% Trito nX-100孵育，PBS洗，5%牛血清白蛋白封閉10min，分別加入一抗小鼠抗人HMB-45(1:100)，NKI/beteb(1:100)單克隆抗體孵育2h。PBS洗，加免疫組化二抗辣根酶標記山羊抗小鼠IgG孵育30min。PBS洗，SP反應，DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察攝片。

2結果

2.1 激光共聚焦顯微鏡:激光共聚焦顯微鏡觀察NKI/beteb抗體免疫熒光標記顯示，毛球部熒光強度高，呈簇集狀，沿毛球線形分布(圖1A)。在毛囊的橫斷面或斜切面上，熒光在毛囊周圍及其附近皮脂腺結構處明顯，呈線狀勾勒出毛囊的切面的輪廓，在表皮基底部，熒光呈點線狀分布(圖1B)。在毛外根鞘中下段可以清楚的看到，均勻分布的熒光染色，放大后可見1～2個細胞聚集在一起(圖1C)。HMB-45抗體免疫熒光標記顯示，在毛囊的縱切面上，熒光在毛漏斗部和毛球部處明顯，呈線狀勾勒出毛球的切面的輪廓;熒光在表皮基底均勻分布(圖1D)。在毛囊的橫切面上，熒光在毛囊周圍，皮脂腺周圍增強(圖1E)。根據外形推測這兩個毛囊，為休止期毛囊。其熒光最顯著處，推測是毛球底部、毛乳頭區(圖1F)。但是，熒光在毛囊外根鞘出沒有分布，這表明外根鞘細胞HMB-45表達陰性。

綜合以上觀察，在胎兒頭皮中NKI/beteb陽性細胞大多分布于毛囊毛球部，毛漏斗部，皮脂腺，表皮基底部和毛囊外根鞘中下段。HMB-45陽性的細胞大部分位于毛囊毛囊漏斗部，毛球部，皮脂腺和表皮基底部，而毛囊外根鞘上的細胞表達HMB-45呈陰性。

2.2 倒置顯微鏡觀察:倒置顯微鏡觀察NKI/beteb染色，顯示毛囊的斜切面，NKI/beteb染色陽性的棕色顆粒，分布在毛球部及外根鞘中下部部位(圖2A)。在毛漏斗部及其周圍的皮脂腺也有陽性細胞分布(圖2B)，進一步放大倍數可以看到，在毛球部聚集陽性細胞。這些陽性細胞2～3個聚集，體積比較小，無明顯樹突，形態與其周邊的細胞相類似，但是其周邊細胞中無陽性顆粒 (圖2C)。HMB-45染色，顯示陽性細胞位于毛母質(圖2D)，毛囊毛球部有陽性細胞分布，呈棕褐色顆粒，簇集狀分布(圖2E);皮膚基底部也散在分布陽性細胞，呈點狀線性分布(圖2F)。

綜合以上觀察，NKI/beteb抗體染色顯示，陽性細胞分布在毛球，毛漏斗部及外根鞘，在外根鞘的中下段，有少數成群分布的被染成褐色的細胞，胞體較扁圓，無明顯樹突。HMB-45抗體染色顯示，在外毛根鞘上細胞均呈陰性，而在毛母質區和毛球部為陽性。

3討論

人黑素細胞起源于神經嵴，在胚胎發育早期(2～5周)逐步向毛囊、表皮等處移行。在其移行過程中，有少數成黑素細胞在中途停滯或者開始轉化成為無黑素合成活性并且未活化的黑素細胞(Amelanotic Melanocyte， AMMC)。早在1954年，Chase提出在毛囊上外跟鞘部存在一群細胞，它們不僅能夠再生毛囊，還可以再生皮脂腺和濾泡間上皮。在每個毛囊周期期間這些細胞導致毛囊皮脂腺單位的重塑。現在已知這種重塑由存在于毛囊內的干細胞系控制。在人類毛囊中已經鑒定出幾種類型的干細胞，包括表皮干細胞、間充質樣干細胞[3-4]、黑素細胞干細胞[5]和巢蛋白陽性干細胞[6-7]。已經證實這些細胞在毛囊中既存在于不同微環境，又交錯在一起。鼠黑素母細胞的分化增殖條件已被廣泛研究，研究者們認為毛囊和皮膚的黑素細胞干細胞來源于這些細胞[8-9]。在毛囊外毛根鞘處可以分離和培養出AMMC[10]。在國內外把從毛囊中分離和培養出的黑素細胞稱黑素母細胞[11]。盡管在鼠和人胚胎皮膚中確定并容易鑒定隆突，但是在成人毛囊中隆突并沒有形態學外觀[12]。所以人們日益對隆突干細胞特異性標志物感興趣。

AMCC中的黑素小體發育不成熟，但在基因調控或外界刺激下，激活，增殖，且具有黑素化能力。NKI/beteb和HMB-45單克隆抗體都識別黑素小體上的膜分子蛋白-gp100，前者識別前黑素小體和成熟的黑素小體上的gp100，但后者只識別成熟的黑素小體上的gp100。這可能是由于這兩種抗體識別同一個分子不同的表位。所以，HMB-45單克隆抗體都不能單獨標記出這類黑素細胞。然而可以借助NKI/beteb單克隆抗體等抗體的聯合來識別AMMC。

本次試驗發現，NKI/beteb陽性細胞是位于外毛根鞘中下段，毛球部，毛漏斗部及其皮脂腺。但在HMB-45染色中，陽性細胞在毛母質，毛球部。外根鞘中沒有HMB-45陽性細胞。因此筆者推測外毛根NKI/beteb陽性染色的細胞就是AMMC，它們僅表達前黑素小體的相關抗原，卻不表達黑素小體的相關抗原以及黑素合成的相關酶蛋白。這些研究也表明，毛球部也有AMMC，其功能具有不成熟性。

黑素母細胞的研究，對于色素性疾病的防治有重要意義[13-14]。激活毛囊外黑素母細胞，促進其移行到表皮，對白癜風等色素減退性疾病的治療起著重要的作用;研究黑素細胞轉移相關因子，找到其中的關鍵因素，可以進一步理解黑素瘤的形成和轉移。本次實驗對進一步研究分離黑素母細胞，促進其增值分化，奠定一定的基礎。

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[收稿日期]2010-04-20 [修回日期]2010-06-24

編輯/張惠娟