組織工程化犬氣管的生物力學(xué)研究

[摘要]目的:通過(guò)檢測(cè)不同方法處理的脫細(xì)胞犬氣管基質(zhì)在無(wú)載荷及零應(yīng)力狀態(tài)下的張開(kāi)角和殘余應(yīng)變，并對(duì)組織工程化氣管的力學(xué)性能進(jìn)行初步探討。方法:取犬的第5～10氣管環(huán)，分別進(jìn)行酶消化法和深低溫冷凍法處理，測(cè)量制成的脫細(xì)胞犬氣管基質(zhì)與新鮮氣管在無(wú)載荷及零應(yīng)力下的張開(kāi)角及殘余應(yīng)變。結(jié)果:新鮮犬氣管的張開(kāi)角大于2組脫細(xì)胞犬氣管基質(zhì)的張開(kāi)角，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酶消化法脫細(xì)胞犬氣管基質(zhì)的張開(kāi)角及殘余應(yīng)變大于深低溫冷凍組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:不同方法脫細(xì)胞處理后，犬氣管的徑向支撐性能將受到影響，其中酶消化法構(gòu)建的組織工程氣管基質(zhì)抗壓縮能力優(yōu)于冷凍法處理組的氣管基質(zhì)。

[關(guān)鍵詞]組織工程;犬;氣管;生物力學(xué);張開(kāi)角

[中圖分類號(hào)]R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2010)07-1015-03

Biomechanical research of tissue engineered canine trachea

ZHANG Wen-hao1，HUO Ran1，LI Shang-bin2，YU Qing-ping3，ZHAO Yang1，GAO Feng1

(1.Department of Cosmetology and Plastic and Burn， Provincial Hospitial Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，Shandong， China; 2.Department of Nuclear Medicine， Provincial Hospitial Affiliated to Shandong University; 3. Heze Municipal Hospital of Shandong Province)

Abstract:ObjectiveTo find the basic mechanical properties of tissue engineered trachea by detecting the opening angles and residual strains of acellular matrix of canine tracheas in the no-load and zero-stress states.Methods The 5th～10th tracheal rings below thyroid cartilage of canine were respectively treated with modified Courtman enzyme digest method and cryopreserved method. Then detect the opening angles and residual strains of these two acellular matrix groups and fresh trachea group in the no-load and zero-stress states.ResultsThe opening angles of fresh trachea group were larger than those two acellular matrix groups with statistical difference. The opening angles and residual strains of modified Courtman method group were larger than cryopreserved method group with statistical difference. ConclusionBoth modified Courtman method and cryopreserved method can influencethe radial sustain of canine tracheas， the tissue engineered acellular matrix treated with modified Courtman has a better anti- compressibility than cryopreserved tracheal acellular matrix.

Key words:tissue engineering; canine; trachea; biomechanics; opening angle

各種原因如創(chuàng)傷、腫瘤等引起的長(zhǎng)段的氣管缺損，因吻合口張力過(guò)大而不能直接縫合時(shí)，需要用人工氣管來(lái)修復(fù)，其中組織工程化氣管因其在免疫排斥、材料來(lái)源等方面的優(yōu)勢(shì)逐漸成為氣管重建外科的研究熱點(diǎn)。組織工程化氣管較為常用的去抗原方法有深低溫冷凍和酶消化法。本實(shí)驗(yàn)主要探討這兩種方法處理后的脫細(xì)胞氣管基質(zhì)的生物力學(xué)性能較新鮮氣管有無(wú)明顯變化，并推測(cè)氣管移植后的塌陷是否與處理方法的不同造成的力學(xué)性能變化有關(guān)。

Han[1]和Fung[2]指出零應(yīng)力氣管扇形體雖然不是圓形的，但是利用扇形體內(nèi)壁中點(diǎn)與內(nèi)壁兩端點(diǎn)連線的夾角所定義的張開(kāi)角依然可用來(lái)描述氣管扇形體的主要特征。我們采用Han 和Fung相同的方法取得犬氣管的無(wú)載荷狀態(tài)和零應(yīng)力狀態(tài)。仔細(xì)檢測(cè)犬氣管無(wú)載荷狀態(tài)的內(nèi)、外壁周長(zhǎng)和零應(yīng)力狀態(tài)的內(nèi)、外壁弧長(zhǎng)以及張開(kāi)角，計(jì)算其殘余應(yīng)變，將深低溫冷凍法和酶消化法犬脫細(xì)胞氣管基質(zhì)與新鮮犬氣管的各項(xiàng)指標(biāo)相比較，以研究其變化趨勢(shì)，為組織工程化氣管的進(jìn)一步研究做力學(xué)方面的初步探討。

1材料和方法

將實(shí)驗(yàn)用成年犬(雌雄不限)按30mg/kg靜脈注射3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液麻醉，切取頸段氣管甲狀軟骨下第5～10環(huán)氣管段，仔細(xì)剔除氣管外壁結(jié)締組織，4℃D-Hanks清洗保存?zhèn)溆茫瑹崛毖獣r(shí)間少于15min。選取直徑及形態(tài)相近的氣管段，分別用于新鮮氣管測(cè)量、程控降溫冷凍保存、改良的Courtman方法[3]氣管黏膜脫細(xì)胞處理。

1.1 深低溫冷凍組處理方法

1.1.1冷凍保護(hù)劑成分:胎牛血清 20%、二甲基亞砜(DMSO)10%、青霉素50U/ml、鏈霉素50mg/ml。

1.1.2 冷凍方法:所取氣管段分別移入注滿冷凍保護(hù)劑的無(wú)菌生物冷凍管中，每管裝1個(gè)氣管段，使氣管段浸沒(méi)于冷凍保護(hù)液中，封口后置于4℃冰箱中冷平衡30min，應(yīng)用程控降溫儀程序降溫，降溫速率為1℃/min，降至-80℃后取出，迅速放入-196℃的液氮中保存6周。測(cè)量前將冷凍管從液氮罐中取出，置入37℃恒溫水浴震蕩箱中，輕輕搖動(dòng)，使氣管段均勻快速解凍復(fù)溫。

1.2 改良Courtman法氣管黏膜脫細(xì)胞組處理方法

1.2.1使用1%Triton X-100和2U/ml脫氧核糖核酸酶(DNAse)、1mg/L核糖核酸酶(RNAse)聯(lián)合順序作用于氣管組織，以脫去粘膜細(xì)胞。為防止蛋白酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原成分產(chǎn)生破壞，在消化液中加入蛋白酶抑制劑(Aprotinin)和EDTA，抑制蛋白酶作用，保護(hù)膠原成分結(jié)構(gòu)完整。配置消化液如下:A液:pH=8的Tris-Hcl緩沖液(1000ml含6.05g Tris堿，0.2gEDTA、10萬(wàn)KIU Aprotinin);B液:pH=8的Tris-Hcl緩沖液(1000ml含6.05g Tris堿，87.7gNaCl、0.2gEDTA、10萬(wàn)KIU Aprotinin);C液:pH=7.4的Tris-Hcl緩沖液(1000ml含10ml Triton X-100、0.2gEDTA、10萬(wàn)KIU Aprotinin);D液:pH=7.6的Tris-Hcl緩沖液(1000ml含有DNAseⅠ2000U、RNAseA 1mg、MgCl21.22g、CaCl21.11g)。

1.2.2消化步驟如下:①加入消化液A，恒溫?fù)u床4℃震蕩24h，每8h更換新的消化液;②加入消化液B，恒溫?fù)u床4℃震蕩24h，每8h更換新的消化液;③4℃ D-Hanks震蕩洗滌4次，每次15min;④加入消化液C，恒溫?fù)u床4℃震蕩24h，每8h更換新的消化液;⑤所取4℃D-Hanks震蕩洗滌4次，每次15min;⑥加入消化液D，恒溫?fù)u床37℃震蕩4h;⑦加入消化液C，恒溫?fù)u床4℃震蕩24h;⑧4℃ D-Hanks震蕩洗滌48h，4℃ D-Hanks內(nèi)保存?zhèn)溆?/p>

1.3 氣管無(wú)載荷狀態(tài)的內(nèi)、外壁周長(zhǎng)以及零應(yīng)力狀態(tài)的內(nèi)、外壁弧長(zhǎng)和張開(kāi)角的測(cè)量方法:用著色筆分別標(biāo)明氣管軟骨部分和肌肉部分的中點(diǎn)，垂直于氣管縱軸方向，將相鄰軟骨環(huán)之間的韌帶剪斷，使之成為無(wú)載荷狀態(tài)的獨(dú)立氣管環(huán)，按順序盛放在裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放在掃描儀上直接掃描， 從而將無(wú)載荷狀態(tài)氣管環(huán)的幾何信息數(shù)字化存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。取得信息后，將氣管環(huán)自掃描儀上取下，從氣管環(huán)肌肉部分中點(diǎn)剪開(kāi)，從而得到零應(yīng)力狀態(tài)下氣管扇形體，將其放回培養(yǎng)皿中，靜置20min，待其形態(tài)穩(wěn)定后，再放回掃描儀進(jìn)行掃描，從而取得零應(yīng)力狀態(tài)下氣管環(huán)的數(shù)字幾何信息(圖1)。最后，運(yùn)用專用圖像分析軟件處理掃描所得圖像， 測(cè)得無(wú)載荷狀態(tài)氣管環(huán)和零應(yīng)力狀態(tài)氣管扇形體的內(nèi)、外壁弧長(zhǎng)以及張開(kāi)角等幾何尺寸。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Q檢驗(yàn)(Newman-kueuls法)。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察:如圖1所示，分別為各組無(wú)載荷狀態(tài)下犬氣管環(huán)掃描圖像和各組零應(yīng)力狀態(tài)下犬氣管扇形體掃描圖像。A組為新鮮氣管組，B組為深低溫冷凍組，C組為改良Courtman法氣管黏膜脫細(xì)胞組。其中圓弧部分為氣管環(huán)的軟骨，直線部分為肌肉部分。剪開(kāi)前大體觀察可見(jiàn)各組樣本大小、形態(tài)相近，無(wú)明顯結(jié)構(gòu)異常。

2.2 氣管的張開(kāi)角:檢測(cè)各組犬氣管零應(yīng)力狀態(tài)下扇形體，分別測(cè)量其內(nèi)壁中點(diǎn)與兩端點(diǎn)連線所成的張開(kāi)角。結(jié)果見(jiàn)表1。檢測(cè)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間兩兩比較采用Q檢驗(yàn)。

結(jié)果(表2)示:新鮮氣管組張開(kāi)角為103.632°±11.695°，深低溫冷凍法脫細(xì)胞組的張開(kāi)角38.889°±11.814°，改良Courtman法脫細(xì)胞組張開(kāi)角為72.332°±14.8258°，組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。由此可初步推斷，采用這兩種方法進(jìn)行脫細(xì)胞處理對(duì)氣管的生物力學(xué)性能均會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，而采用改良Courtman法進(jìn)行脫細(xì)胞處理對(duì)氣管力學(xué)性能的負(fù)面影響較冷凍方法來(lái)講對(duì)小一些。

2.3氣管內(nèi)外壁周長(zhǎng)及其伸長(zhǎng)比:測(cè)量各組犬氣管環(huán)及剪開(kāi)后氣管扇形體，分別獲得無(wú)載荷狀態(tài)下氣管環(huán)內(nèi)壁周長(zhǎng)Ci、外壁周長(zhǎng)Co，零應(yīng)力狀態(tài)下氣管扇形體內(nèi)壁弧長(zhǎng)Li、外壁弧長(zhǎng)Lo。檢測(cè)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示。計(jì)算出內(nèi)、外壁伸長(zhǎng)比為:λi=Ci/Li，λo= Co/Lo，(公式1)。由定義可得出在無(wú)載荷狀態(tài)下殘余應(yīng)變(格林應(yīng)變Green strain)的數(shù)學(xué)計(jì)算公式為Ei=(λi2-1)/2，Eo=(λo2-1)/2，(公式2)。

結(jié)果(表1)示:各組犬氣管內(nèi)、外壁伸長(zhǎng)比均大于1，即內(nèi)外壁周長(zhǎng)剪開(kāi)后均有縮短，這與國(guó)內(nèi)王憶勤[3]教授等對(duì)大鼠氣管測(cè)量結(jié)果(λi<1，λo>1)有所不同。對(duì)三組標(biāo)本λi、λo進(jìn)行方差分析，結(jié)果可認(rèn)為各組間內(nèi)、外壁伸長(zhǎng)比(λi、λo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)而進(jìn)行三組之間兩兩比較，B組內(nèi)、外壁伸長(zhǎng)比均小于其余2組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而A、C組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此結(jié)果可看出，在無(wú)載荷狀態(tài)下，三組犬氣管內(nèi)外壁均處于拉伸狀態(tài)，且冷凍氣管組外壁拉伸比另外兩組均小，而新鮮氣管組與改良Courtman法脫細(xì)胞組的內(nèi)外壁拉伸比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 氣管的周向殘余應(yīng)變:根據(jù)公式計(jì)算出各組氣管標(biāo)本的殘余應(yīng)變，并分別對(duì)內(nèi)壁殘余應(yīng)變Ei及外壁殘余應(yīng)Eo行方差分析。結(jié)果(表2)示:各組均數(shù)不相等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組間兩兩比較顯示B組Ei 、Eo均小于另外兩組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而A、C兩組Ei、Eo差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。據(jù)此推斷，經(jīng)改良Courtman法脫細(xì)胞處理的氣管與新鮮氣管的徑向抗壓縮能力無(wú)顯著差異，而深低溫冷凍組氣管徑向抗壓縮能力小于其余兩組。

2.5張開(kāi)角與殘余應(yīng)變的關(guān)系:以上分別對(duì)張開(kāi)角及殘余應(yīng)變得分析可以看出，新鮮組氣管張開(kāi)角比另外兩組脫細(xì)胞處理組大，不同方法脫細(xì)胞處理的兩組氣管基質(zhì)之間張開(kāi)角也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但經(jīng)改良Courtman法脫細(xì)胞處理的氣管與新鮮氣管的內(nèi)、外壁殘余應(yīng)變并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。從整體上來(lái)比較，張開(kāi)角較大的氣管組其內(nèi)、外壁殘余應(yīng)變也較大，這個(gè)結(jié)果再一次印證了Fung關(guān)于張開(kāi)角是殘余應(yīng)變直觀表示的重要論斷，也與國(guó)內(nèi)復(fù)旦大學(xué)柳兆榮、王憶勤[4]等對(duì)大鼠氣管測(cè)量所得結(jié)果相符合。

3討論

本次實(shí)驗(yàn)又一次驗(yàn)證了氣管在零載荷狀態(tài)下存在殘余應(yīng)變，剪開(kāi)后在殘余應(yīng)力的作用下將形成具有一定張開(kāi)角的扇形體[6]。與以往國(guó)內(nèi)對(duì)大鼠氣管進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不同點(diǎn)在于，以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠氣管內(nèi)壁伸長(zhǎng)比小于1，內(nèi)壁殘余應(yīng)變小于0，即剪開(kāi)前大鼠內(nèi)壁氣管處于壓縮狀態(tài)，其內(nèi)徑周長(zhǎng)小于剪開(kāi)后的內(nèi)弧長(zhǎng)[4]。而本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有三組犬氣管標(biāo)本的內(nèi)壁伸長(zhǎng)比均大于1，即從整體上看，犬氣管內(nèi)壁并未發(fā)現(xiàn)存在壓縮現(xiàn)象。滕忠照[5]等曾做過(guò)大鼠氣管兩次剪開(kāi)的實(shí)驗(yàn)，將大鼠氣管肌肉部分和軟骨部分分別剪開(kāi)，發(fā)現(xiàn)除靠近氣管杈的氣管環(huán)外，大鼠氣管的肌肉內(nèi)外壁均有位拉伸狀態(tài)。據(jù)此分析，由于犬氣管的直徑遠(yuǎn)大于大鼠氣管，其肌肉部分彈性回縮很大程度上抵消掉了氣管軟骨部分的形變，所以在整體上計(jì)算，犬氣管內(nèi)壁伸長(zhǎng)比大于1。由于犬氣管與人體氣管大小更接近，這一結(jié)果將有助于對(duì)人氣管的力學(xué)性能的進(jìn)一步研究。

Fung指出[6]，活組織生長(zhǎng)取決于應(yīng)力，在一定壓力載荷下，氣管將產(chǎn)生適應(yīng)性生長(zhǎng)，使其與所處的力學(xué)環(huán)境相適應(yīng)，氣管張開(kāi)角是殘余應(yīng)變的直觀表示，可以用張開(kāi)角來(lái)定量表示氣管的殘余應(yīng)變[4]，并進(jìn)一步推斷其徑向抗壓縮能力。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，新鮮氣管的張開(kāi)角明顯大于進(jìn)行脫細(xì)胞處理后的兩組氣管基質(zhì)。這說(shuō)明將氣管進(jìn)行脫細(xì)胞去抗原處理的過(guò)程中，各種物理及化學(xué)因素將對(duì)氣管的抗壓縮性能產(chǎn)生一定程度的不利影響。而本次實(shí)驗(yàn)所采用的兩種脫細(xì)胞方法對(duì)氣管的抗壓縮性能產(chǎn)生的影響也不盡相同。以往對(duì)于氣管移植的研究主要集中在去抗原處理[7-10]上，而在處理過(guò)程中可能會(huì)造成氣管徑向抗壓縮能力下降并未引起人們過(guò)多重視，對(duì)于術(shù)后氣管的塌陷也大多從免疫反應(yīng)及血液供應(yīng)等方面考慮，對(duì)氣管本身支撐能力下降并未有明確研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同方法處理后犬脫細(xì)胞氣管基質(zhì)的支撐性能的初步研究，可望為以后組織工程化氣管的進(jìn)一步研究提供力學(xué)方面參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Han HC，F(xiàn)ung YC.Residual strains in porcine and canine trachea[J].J of Biomechanics，1991，24:307-315.

[2]Fung YC.Biomechanics:Motion，F(xiàn)low，Stress，and Growth[M].New York:Springer Verlag，1990.676-680.

[3]Courtman DW，Pereira CA，Kashef V，et a1.Development of a pericardial acellular matrix biomaterial; biochemical and mechanical effects of cell extraction[J].J Biomed Mater Res，1994，28(6):655-6 66.

[4]柳兆榮，王憶勤，滕忠照，等.正常大鼠氣管的張開(kāi)角與殘余應(yīng)變[J].中國(guó)科學(xué)，C 輯，2001，31(6):557-564.

[5]滕忠照，柳兆榮，林逸漢，等.大鼠氣管軟骨和肌肉殘余應(yīng)變研究[J].中國(guó)科學(xué)，C輯，2004，34(3):284-290.

[6]馮元楨著.生物力學(xué)--運(yùn)動(dòng)、流動(dòng)、應(yīng)力和生長(zhǎng).鄧善熙譯[M].成都:四川教育出版社，1993:382-400.

[7]Davreux CJ ，Chu NH. Improved tracheal allograft viability in immunosuppressed rats[J].Ann Thorac Surg，1993，55:131-134.

[8]Takashi T，Kazuo N，Noriyoshi S，et al. Tracheal replacement with cryopreserved tracheal allograft : experimental in dogs[J].Ann Thorac Surg，1998，66:209-213.

[9]楊繼承，胡建國(guó)，吳忠仕，等.異體氣管移植去抗原性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2006，20(1) :73-76.

[10]楊壯群，侯成群，常曉峰，等.同種軟骨移植后基質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，1997，6(1):14-17.

[收稿日期]2010-04-21 [修回日期]2010-06-25

編輯/張惠娟