蠐螬高毒力蘇云金芽孢桿菌研究

摘 要:蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)能產生具有強烈殺蟲作用的晶體蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、同翅目等節肢動物，以及動植物線蟲、蜱螨等都具有特異性的毒殺活性，而對非目標生物安全。目前，通過現代生物技術和基因工程的方法對蘇云金芽孢桿菌進行改造，擴大其殺蟲譜，提高殺蟲毒力，使多種因素和成分發揮作用，害蟲不易產生抗藥性，避免了化學農藥所帶來的環境污染和抗性問題。

關鍵詞:蘇云金芽孢桿菌;高毒力;生物防治

中圖分類號:S3

文獻標識碼:A

文章編號:1672-3198(2010)09-0353-02

1 蘇云金芽孢桿菌的研究歷史

1901年日本學者S.Ishiwata報道了從猝倒死亡的家蠶體內分離出一種桿狀細菌，即Bt猝倒亞種(Bacillus thuringiensis subsp. scotto)，從而揭開了人類對蘇云金芽孢桿菌的研究史。1911年Berliner報道了從德國蘇云金省染病的地中海粉螟中分離出一種桿菌并定名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。1927年，Matts再次從地中海粉螟中分離出類似的桿菌并沿用了蘇云金芽孢桿菌的名稱，這就是現在的模式種蘇云金亞種Matts和Berliner(Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis Matts or Berliner)。1938年，第一個蘇云金芽孢桿菌商品制劑問世，用于防治地中海粉螟。到1953年Hannay第一次發現蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性與伴孢晶體有關，并與Fitz-James一起證實了伴孢晶體是一種蛋白質。Dulmage(1970)篩選出對夜蛾科毒力較高的菌株HD-1，并以此建立了標準品的生物測定程序，實現了蘇云金芽孢桿菌制劑的標準化。1962年，Barjac等首先根據生理生化反應和鞭毛抗原(H)血清反應的不同，把蘇云金芽孢桿菌劃分為6個亞群。1967年、1968年Heimpel把形態特征、生化反應、H型和酯酶型結合在一起，提出了產伴孢晶體的細菌分類表。1976年Zakharyon最先提出:質?？赡軐Π殒呔w的編碼起作用。Debabiov等(1977)證實蘇云金芽孢桿菌確實含有質粒，伴孢晶體的形成和質粒有關。同時Goldberg和Mangalit(1977)分離出對雙翅目幼蟲有特異活性的ONR菌株(subsp. israelensis)，成為蘇云金芽孢桿菌開拓性研究的起點。1981年Schnepf和Whiteley克隆出蘇云金芽孢桿菌的第一個cry基因，并于1985年發表了它的核酸序列，標志著Bt研究跨入了分子生物學時代。1995年Crickmore等提出了新的cry基因分類系統。2004年9月11日，美國能源部的Brettin等在NCBI上公布了Bt 97-27的基因組全序列，標志著對Bt的研究進入了基因組時代。2007年7月發現了cry52和cry53，cry基因已達53類。截止2009年7月，確定并公布的殺蟲基因已達400余種。

2 蠐螬的危害現狀

2.1 我國蠐螬的發生危害

蠐螬分布廣泛，發生遍及全國各地，占地下害蟲總蟲量的70-80%以上，據粗略統計，全國每年蠐螬危害造成的產量損失達到20%以上。蠐螬危害植物種類多，包括除了水田植物之外的糧食、棉花、蔬菜、油料、糖料、煙草、麻類、牧草、中草藥、花卉、草坪及果樹、林木等多種植物。發生面積最大、蟲量較多的是黃淮海地區，主要危害糧食、油料等作物;危害甘蔗的蠐螬，在廣東、廣西、福建、四川、云南等地發生普遍;在西藏、新疆、青海、甘肅等省(自治區)蠐螬發生也非常嚴重。它一般為多個種類混雜發生，生活史多為1-2年或3年一代，危害時間長，從春季到秋季，從播種至收獲，咬食植物的幼苗、根、莖、種子及塊根、塊莖、莢果等。苗期受害，造成缺苗斷壟;生長期受害，破壞根系組織，啃食嫩果，使植株矮小變黃，降低產量，影響品質。

2.2 花生蠐螬的危害

蠐螬是花生產區的主要害蟲。2003-2004年筆者在河北定州市調查，暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)危害嚴重，造成花生嚴重減產，嚴重地塊花生產量不足50公斤/畝;2005-2008年調查，銅綠麗金龜(Anomala corpulenta)是近幾年花生的主要地下害蟲，其發生占蠐螬總數的30-45%(未發表資料)。劉廣瑞等報道，山東省的花生由于受到蠐螬的危害，每年減產約10萬噸，優勢種為華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)、暗黑鰓金龜。李素娟等報道，2000年河南拓城縣一農戶每畝只收花生5kg，2002年河南濮陽縣一農戶每畝只收花生25kg，但空殼占60%以上。2003-2007年江新林對山東菏澤地區農田金龜子成蟲的發生進行誘集調查，主要蟲種為暗黑鰓金龜、銅綠麗金龜、黃褐麗金龜(A. exoleta)及大云斑鰓金龜(Polyphylla laticollis)。2003-2005年銅綠麗金龜為主要優勢蟲種，2006、2007年暗黑鰓金龜的數量增加，占總蟲量的72.4%。2007年調查田間幼蟲發生情況，花生田蠐螬數量最多，蟲量為每平方米6.52頭。

2.3 草坪蠐螬的危害

近年來，由于草坪草多年生、不翻耕的特點，蠐螬對草坪的危害日益嚴重，短時間內即可將成片草坪破壞得殘缺不全，輕者影響草坪的美觀，重者造成草坪大面積枯死;用手輕提，就能揭起大片草坪，并可看到大量的幼蟲，由此造成超過60 %的草坪被毀。羅晨2004-2006年在北京及其周邊地區對草坪生產基地、綠化草坪、高爾夫球場草坪及運動場草坪地下害蟲蠐螬種類和為害進行了調查，華北大黑鰓金龜、黃褐麗金龜和銅綠麗金龜是重要的為害種。徐志宏對高爾夫球場蠐螬種類的調查結果，銅綠麗金龜子是高爾夫球場蠐螬的優勢種，中華喙麗金龜子(Adoretus sinicus Burmeister)、蒙古麗金龜子(Anomala mongolia)及四紋麗金龜子(Popillia quadriguttata)為次優勢種。

2.4 蠐螬的其他危害

蠐螬對馬鈴薯、大豆、甘蔗等危害也非常嚴重。蠐螬咬食馬鈴薯種子和根莖，造成缺苗斷壟，而且在結薯期蛀食塊莖，被害傷口容易感染鐮刀菌和軟腐菌，造成爛薯，使馬鈴薯減產，品質下降。大豆進入分枝結莢期時，受蠐螬害植株出現葉片發黃、枯死。受害較輕田塊的植株表現為零星死亡;受害重的田塊全田植株倒伏、枯死，側根大部分吃光，僅剩主根。因為根部嚴重受害，造成植株全部倒伏，豆莢呈空癟狀。

甘蔗蠐螬又名蔗龜，對甘蔗的生長造成了極大的危害。以蔗龜的成蟲危害嚴重，成蟲咬食甘蔗植株的基部，形成半球形缺口，引起地上部有1-2片葉干枯，若咬食更深，則造成枯心，一般枯心率20-40%，個別達80-90%。甘蔗受害后不再分蘗，蔗芽受害形成缺苗缺株。1-3齡幼蟲取食蔗根，并在地下部蛀成孔洞，使蔗株易遇風折倒，影響甘蔗的產量和品質。

3 對蠐螬高毒力蘇云金桿菌的篩選

對金龜子防治以往多采用化學防治的方法，但隨著其對化學殺蟲劑的抗性日益增強，化學防治的方法對其效果甚微;同時金龜子對目前己發現的絕大多數蘇云金桿菌菌株的毒素不敏感或低敏感，已商業化的蘇云金桿菌殺蟲劑對其基本無效。針對這一問題，以金龜子為試蟲開展篩選和分離工作，篩選出對金龜子具有高毒力殺蟲活性的蘇云金桿菌菌株，用以研制開發成高效的金龜子蘇云金桿菌殺蟲劑，在農業生產中具有極其重要的實際意義。

1977年以色列亞種的發現打破了長期以來認為Bt只對鱗翅目昆蟲具有毒殺作用的固有觀念，人們開始了蘇云金桿菌對其它害蟲高毒力菌株的篩選，1983年發現了對鞘翅目馬鈴薯甲蟲有活性的擬步行甲亞種，1991年又發現了對線蟲有效的菌株。目前，新菌株、新殺蟲特性、新殺蟲蛋白及其編碼基因的發現和報道層出不窮。到目前為止，其殺蟲譜己達到包括鱗翅目、鞘翅目、直翅目、同翅目和膜翅目等522種害蟲。因此，篩選具有高毒力殺蟲活性的新菌株始終是Bt研究最活躍的領域之一。

在1998年我國篩選出對金龜子幼蟲具有殺蟲活性的Bt特異性新菌株，在研究上取得了突破性的進展。在河北省的土壤中成功分離獲得了一株Bt新分離株HBF-1。研究發現，HBF-1菌株對我國危害嚴重的銅綠麗金龜、黃褐麗金龜等金龜子類害蟲具有較高的殺蟲活性，尤其對1-2齡的黃褐麗金龜的幼蟲殺蟲效果可達到100%。

4 高毒力蘇云金桿菌的應用現狀

Bt作為生物殺蟲劑經歷了三個發展階段:1980年以前，Bt殺蟲劑主要是利用自然菌株生產的第一代Bt，以質粒接合轉移和質粒消除方法而生產出的Foil等為第二代;通過基因工程方法構建的第三代Bt問世。不斷發現的Bt基因，正在幫助人類將Bt變成活性高、殺蟲范圍廣的生物殺蟲劑。Bt生物殺蟲劑在應用過程中暴露出一些局限性，如毒力不強、殺蟲譜窄、持效期和貨架期短、害蟲產生抗性等。利用基因重組和基因異源表達等技術，可以擴大殺蟲譜，延長持效期并改善釋放性能和提高毒力等。

目前商品化的Bt殺蟲劑主要源自庫斯塔克亞種，如HD-1及類似菌株。將cry1C基因導入這類菌株后，可擴充其對甜菜夜蛾等昆蟲的活性。開發出的產品或制劑有美國的Cutlass和我國的WG系列、Bt-TnY。cry3A基因也被導入庫斯塔克亞種，擴充其對鞘翅目昆蟲的毒力，如美國的Foil和SAN418以及我國的803-1(3A)和UV-17(3A)。我國也已研制出將cry1Ac導入殺鞘翅目Bt菌株的廣譜重組殺蟲劑LCJ-12等。

5 防治蠐螬的高毒力蘇云金桿菌的發展與展望

5.1 昆蟲病原細菌防治金龜子

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是目前世界上應用最廣泛的昆蟲病原微生物，上世紀80年代前主要用于防治鱗翅目和雙翅目害蟲。在國內，1998年馮書亮等分離獲得蘇云金桿菌HBF-1菌株，對黃褐麗和銅綠麗金龜表現出較高的殺蟲活性，這是我國首次發現并報道的對金龜子幼蟲具有殺蟲活性的Bt菌株。HBF-1菌株懸浮劑防治花生田金龜子幼蟲的田間小區試驗結果表明，50倍液的蟲口減退率為71.4%-75.4%，保果效果為58.7%-72.9%。

乳狀菌僅在金龜幼蟲中被發現，屬于專性寄生病原體，是由金龜子芽孢桿菌Paenibacillus popilliae(A型)和緩死芽孢桿菌Paenibacillus lentimorbus(B型)引起的，由于罹病的幼蟲體征呈現特殊的乳白色(Milky disease)，稱之為乳狀菌。1940s-1960s，在美國大規模培養乳狀菌用來防治日本麗金龜取得了良好的控制效果。以活體繁殖技術生產的專利產品有“Doom”、“Sapidemin”、“Milky spore”等，但是，乳狀菌的生產有許多問題有待解決，如活體繁殖生產菌劑成本高，離體大量生產菌劑技術尚未完全解決，因而限制了它的廣泛使用。沙雷氏菌(Serratia spp.)是一種非產孢的病原細菌，嗜蟲沙雷氏菌Serratia entomophila和變形斑沙雷氏菌S. proteamachulans可以引起蠐螬的琥珀病。當昆蟲取食了沙雷氏菌菌株后，就會停止取食，清空中腸，最終導致死亡。通常在室內飼養的昆蟲種群中大量發生。在新西蘭，應用S. entomophila或S.proteamachulans處理蠐螬 48 h 后，蠐螬停止取食，72h后蟲體出現琥珀般顏色，從而進入慢性發病階段直至死亡。Jackson 等在應用 S.entomophila 防治褐新西蘭肋翅鰓金龜Costelytra zealandica幼蟲的試驗中發現，經過細菌處理的草坪，蠐螬的種群數量減少，并且存活的蠐螬感染琥珀病的比例達79 %;應用S. entomophila154株系處理庭院草坪上的蠐螬，感病率達46 %，并且S. entomophila可以在蠐螬中建立種群優勢，減輕蠐螬對草坪的破壞。這一生防技術在新西蘭已經應用了十多年。

5.2 防治金龜子的轉基因植物的研究

目前商品化的轉基因植物中使用的Bt基因主要有cry1Ab、cry1Ab/cry1Ac、cry1Fa、cry3Aa、cry3Bb、cry9C、cry34Ab和cry35Ab等多種，其中對鞘翅目葉甲類害蟲高效的基因有cry34Ab、cry35Ab、cry3Aa和cry3Bb等。有報道的在轉基因植物中應用的對鞘翅目金龜子類害蟲高效的基因有cry8Ca基因和cry8Da基因，但目前還未有商品化生產的報道。

2005年，郎志宏對編碼Cry8Ca2蛋白的核苷酸序列進行了改造和密碼子優化，優化的mcry8Ca2(modified cry8Ca2) G+C含量由原來cry8Ca2基因的37%提高到46%。構建了植物表達載體pBTmCN、pBSmCN，采用根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉化煙草，得到了轉化植株。通過對轉化植株的檢測，證明外源基因己轉入煙草基因組中，并在煙草植株中正確表達。將轉基因植株接入黃褐麗金龜和銅綠麗金龜幼蟲，結果對照植株被蠐螬明顯危害，轉cry8Ca2基因植株根部生長完好，發育正常，因此cry8Ca2基因可以在轉基因煙草中表達，并且對蠐螬有毒殺作用。

轉基因植物作為Bt蛋白新的表達系統，具有穩定高效表達的特點。抗金龜幼蟲的殺蟲蛋白基因轉化到植物中，可以使植物的根部組織直接表達殺蟲蛋白，并可多價基因表達，當害蟲取食后直接作用于害蟲的中腸，對害蟲的防效是持續穩定的，可以達到控制害蟲的目的，提高了防治效果，減少了化學殺蟲劑的用量，降低了投入成本，并且對環境無害。因此，利用轉Bt基因植物防治金龜子類地下害蟲必將成為一條新的有效途徑。在這個新的技術領域，需要育種專家和昆蟲學家緊密合作，培育抗蟲品種，解決關鍵技術問題，使其切實成為害蟲防治的有效措施。

5.3 展望

以上所介紹的蘇云金桿菌和轉基因植物，有的已開發出制劑并投入田間應用，有的還只在實驗階段，它們的應用效果和開發前景還有待實踐去檢驗，但其所用的策略和思路值得參考和借鑒。隨著實踐的需要和科學技術的發展，蘇云金桿菌殺蟲劑將朝著高效、廣譜、持效和延緩抗性方向發展，生態殺蟲劑也會有較大的發展空間。同時，蘇云金桿菌殺蟲劑的研究可為轉基因植物提供基因來源，從而為持續有效的控制害蟲的發生和為害，實現農業生產的可持續發展提供技術手段。

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