PPAR激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞的影響

[摘要] 目的 探討過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)激動(dòng)劑羅格列酮(ROT)對(duì)人子宮肌瘤的增值抑制作用及分子機(jī)制。方法 給予原代培養(yǎng)的子宮肌瘤不同濃度的羅格列酮處理，以四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色(MTT)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率;以半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)PPARγmRNA 以及凋亡基因Bax、Bcl-2 在子宮肌瘤細(xì)胞中的表達(dá)及羅格列酮對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖活化的影響。結(jié)果 羅格列酮可抑制體外培養(yǎng)的人子宮肌瘤細(xì)胞增殖，呈時(shí)間和劑量依賴性。RT-PCR 提示羅格列酮可促進(jìn)PPARγmRNA、Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)。結(jié)論 過(guò)氧化物酶增殖物激活受體激動(dòng)劑羅格列酮抑制子宮肌瘤的增值可能是通過(guò)上調(diào)PPARγ、Bax 的表達(dá)及下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用的。

[關(guān)鍵詞] 過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ; 羅格列酮; 子宮肌瘤細(xì)胞; 凋亡

[中圖分類號(hào)] R730 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2010)09-07-04

Influence of Peroxisome Proliferator-activated Receptor Activator on Human Uterine Leiomyoma Cells

QIN Zhongfang1* LI Meirong2△ LIU Tao1

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.The First Clinical Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstrct] ObjectiveTo explore the inhibitive effect of a peroxisome proliferator activated receptor -γ(PPARγ) activator rosiglitazone on leiomyoma cell growth and its molecular mechanism. MethodsHuman leimyoma cells in vitro cultured were treated with different concentrations of rosiglitazone，and MTT assay was used to detect the growth inhibition. The semiquantitative RT-PCR method was used to detect the expression of PPARγm RNA，Bax and Bcl-2 and the effect of rosiglitazone on the proliferation and activation of leiomyoma cells. ResultsRosiglitazone inhibited the in vitro cultured human uterine leiomyoma cell proliferation in a time-and dose-dependent manner. The RT-PCR showed that rosiglitazone promoted the expression of the PPARγm RNA and Bax，and at the same time inhibited the expression of Bcl-2.ConclusionThe PPAR-γ activator，rosiglitazone，inhibits the cell proliferation partly through the up-regulation of PPAR-γand Bax and the down-regulation of Bcl-2 expression.

[Key words]Peroxisome proliferators-activated receptorγ; Rosiglitazone; Leiomyoma; Apoptosis

過(guò)氧化酶體激活物增殖受體(PPAR)屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，共分三個(gè)亞型:PPARα、PPARβ和PPARγ。PPARγ 是當(dāng)前核受體方面研究的熱點(diǎn)，除具有促進(jìn)脂肪形成及抗炎作用外，還有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。許多研究結(jié)果表明PPARγ 激活后可抑制腫瘤細(xì)胞增值及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[1]。羅格列酮(Rosiglitazone，ROZ)是PPARγ 的合成配體，目前至少有160 萬(wàn)左右患者服用列酮類藥物治療糖尿病，有必要明確PPARγ 的功能，包括其在腫瘤中所起的作用[2]。國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于PPARγ 抗腫瘤作用的研究報(bào)道，但是尚缺乏對(duì)子宮肌瘤作用的研究。

子宮肌瘤是女性生殖器官的常見(jiàn)腫瘤，在育齡期婦女中發(fā)病率高達(dá)20%～30%，是導(dǎo)致女性行子宮切除的重要原因之一。本文旨在研究其激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖抑制作用，為進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

合成培養(yǎng)基含10%滅活胎牛血清(FBS)的DMEM，F(xiàn)BS 購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司;Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、Trizol 試劑均為美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品。TaKaRa RT-PCR 試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(購(gòu)自GIBCO 公司);引物由上海生物工程公司合成;DAB 顯色試劑盒均購(gòu)自北京中山公司。羅格列酮由中美史克公司生產(chǎn)的馬來(lái)酸羅格列酮。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 在GenBank 中獲得人類基因PPARγ、Bax、Bcl-2 的全長(zhǎng)cDNA 序列尋找特異性高的序列區(qū)域設(shè)計(jì)引物。PPARγ 的引物為:上游5'-GCTGTGCAGGAGATCACAGA-3'，下游5'-GGGCTCCATAAAGTCACCCAA-3'，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為225bp。Bax 的引物為:上游5'-TGCTTCAGGGTTTCATCCAGGA- 3'，下游5'-ACGGCGGCAATCATCCTCTG-3'，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為172bp。Bcl-2的引物為:5'-CTTCGCCGAGATGTCCAGCCA-3'，下游5'-CGCTCTCCACACACATGACCC-3'，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為152bp。GAPDH 引物為:上游5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為307bp。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 收集山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科2008年11月~ 2009年2月因子宮肌瘤行子宮手術(shù)的病例13例，年齡35～45 歲，術(shù)前3個(gè)月無(wú)類固醇激素使用史，術(shù)后均經(jīng)組織學(xué)證實(shí)。手術(shù)切除子宮后，立即在無(wú)菌條件下取每例子宮肌瘤組織1cm×0.5cm×0.5cm置于PBS緩沖液中，密閉盡快送入細(xì)胞培養(yǎng)室。將肌瘤組織用4℃PBS 緩沖液反復(fù)沖洗并剪碎。吸入離心管內(nèi)靜置，去上清，加入0.1%膠原酶3mL。37℃ 恒溫水浴振蕩6～7h后加入PBS 終止消化，過(guò)濾，1500rpm×10min 離心后，棄上清，加入DMEM 培養(yǎng)液(含10%FBS，青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL)吹打懸浮后，分別種于50mL培養(yǎng)瓶中，置于37℃、飽和濕度、含5% 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)免疫組化兩步法DAB 顯色，鑒定為子宮肌瘤細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2～3天傳代1次。取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞自然生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察和不同濃度羅格列酮作用于細(xì)胞后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 MTT 實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞使用胰蛋白酶消化，制成1×105/mL 單細(xì)胞懸液，接種96 孔培養(yǎng)板，每孔100μL(即1×104個(gè)細(xì)胞)，置37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)，24h 后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)，分別加入不同濃度羅格列酮，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h，實(shí)驗(yàn)終止前4h 加入10 MTT 溶液(5mg/mL)20μL，37℃繼續(xù)孵育4h，中止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10min，用酶標(biāo)儀在490nm 處測(cè)定各孔的吸光度A 值。實(shí)驗(yàn)設(shè)藥物處理組、細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組，每種處理重復(fù)3 次。羅格列酮終質(zhì)量濃度分別為10-6、10-7、10-8mol/L。按下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率:腫瘤細(xì)胞增殖抑制率(%)=1 -(A 藥物處理組-A 空白對(duì)照組)/(A 細(xì)胞對(duì)照組-A 空白對(duì)照組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.5 細(xì)胞總RNA 的提取和目的片段的擴(kuò)增 取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入不同濃度羅格列酮，72h 后加入適量Triol，將細(xì)胞收入EP 管中。此實(shí)驗(yàn)分為空白組、肌瘤加藥組(單純加入羅格列酮，終濃度為10-6、10-7、10-8mol/L)，用RNA 提取試劑盒分別提取各組總mRNA 并立即逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以10μg 總cDNA 為模板，用上述3對(duì)PCR 引物和GAPDH 通用引物分別擴(kuò)增各個(gè)目的片段。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用圖像分析儀進(jìn)行半定量分析，以各個(gè)目的片段與GAPDH 的比值作為其mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，組間差異采用單因素方差分析;兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn);用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

消化后狀態(tài)好的子宮肌瘤細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或橢圓形，在培養(yǎng)24h后觀察貼壁良好，48h左右即開(kāi)始形成細(xì)胞克隆，形態(tài)呈典型的長(zhǎng)梭狀。加入不同濃度的羅格列酮后，培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，部分貼壁細(xì)胞收縮變圓、漂浮。

2.2 羅格列酮對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖抑制的影響

不同濃度羅格列酮(10-6、10-7、10-8mol/L)作用于子宮肌瘤細(xì)胞24、48、72h 后，用MTT 法測(cè)定對(duì)細(xì)胞增值抑制率的影響，如圖1 所示，相同藥物濃度作用72h 肌瘤細(xì)胞增值抑制率與24h、48h 肌瘤細(xì)胞增值率抑制率比較，P<0.05，呈時(shí)間依賴性。不同濃度羅格列酮作用24h 對(duì)子宮肌瘤無(wú)明顯抑制，各組之間細(xì)胞增殖抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而在作用48h、72h 不同程度地抑制子宮肌瘤的增值，隨著藥物濃度的增加，體外培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞的增值抑制率增高，各組之間細(xì)胞的增值抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 羅格列酮對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響

半定量 RT-PCR 結(jié)果顯示，羅格列酮(10-6、10-7、10-8mol/L)作用于子宮肌瘤細(xì)胞72h 后，可明顯升高加藥組細(xì)胞PPARγ、Bax 的表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)水平，呈劑量依賴性。表1為RT-PCR 凝膠電泳掃描PPARγ/GAPDH、Bcl-2/GAPDH、Bax GAPDH 結(jié)果(實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)對(duì)照組之間及實(shí)驗(yàn)組不同濃度間比較差異有顯著性，P值均<0.01)。各組電泳結(jié)果見(jiàn)圖2~5。

3 討論

PPARγ 屬于核受體超家族的成員，過(guò)去幾十年的研究表明，PPARγ在多種腫瘤細(xì)胞，如脂肪瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌等中高表達(dá)，當(dāng)PPARγ激活后在體內(nèi)外可抑制上述腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞凋亡，以及誘導(dǎo)細(xì)胞分化[3-6]。據(jù)此推斷PPARγ激動(dòng)劑對(duì)上述腫瘤有一定的治療和預(yù)防作用。但是PPARγ激動(dòng)劑的抗腫瘤作用機(jī)制還不完全清楚，在不同的腫瘤其作用機(jī)制可能略有不同。

最近研究顯示，PPARγ在人子宮肌瘤組織中的表達(dá)明顯高于其同源的子宮正常平滑肌組織[7，8]。Houston KD 研究組也證實(shí)PPARγ激動(dòng)劑可以抑制雌激素對(duì)EKer 鼠子宮肌瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激作用[9]。所以推測(cè)肌瘤組織PPARγ表達(dá)增高是對(duì)肌瘤細(xì)胞增殖的抑制反應(yīng)。雖然其具體的分子作用機(jī)制不是很清楚，但是可以明確的是PPARγ激動(dòng)劑具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。為探討PPARγ激動(dòng)劑對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞是否具有抗腫瘤作用，本研究運(yùn)用不同濃度羅格列酮體外作用人子宮肌瘤細(xì)胞24h、48h、72h，用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的分析，結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組在加藥24h時(shí)，肌瘤細(xì)胞增殖抑制率改變不明顯，但是在加藥48h、72h 時(shí)，隨著羅格列酮藥物濃度的增加，細(xì)胞增值率明顯上升(P<0.05)，尤以72h為著，這說(shuō)明羅格列酮對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。同時(shí)，本研究中用不同濃度羅格列酮作用肌瘤細(xì)胞72h，用RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示羅格列酮上調(diào)基因PPARγ 和Bax 的表達(dá)，下調(diào)基因Bcl-2的表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明羅格列酮抑制子宮肌瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)可能通過(guò)凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。羅格列酮是PPARγ特異性激活受體，為胰島素受體增敏劑。研究表明PPARγ與配體結(jié)合后被激活，與維甲酸受體(RXRs)形成異源二聚體，再與所調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子上游的一段特定DNA 序列即PPARγ反應(yīng)元件(PPREs)結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)化活化，從而發(fā)揮一系列的生物活性[10]。

Bax 和Bcl-2是細(xì)胞凋亡線粒體途徑中起重要調(diào)節(jié)作用的兩種因子[11]。當(dāng)有凋亡刺激因素存在時(shí)，線粒體膜上的Bax 表達(dá)增高，促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放，后者與Apaf 因子結(jié)合，活化半胱氨蛋白水解酶29，進(jìn)而活化半胱氨蛋白水解酶-3，從而引起凋亡。Bcl-2可通過(guò)多種途徑抑制凋亡的發(fā)生，它可以通過(guò)拮抗Bax 而維持線粒體膜的完整性，還可抑制細(xì)胞色素C的釋放而抑制凋亡，也可釋放死亡促進(jìn)因子(DPF)而起抗凋亡的作用。在胞內(nèi)Bax可與Bcl-2形成異二聚體而拮抗凋亡，Bax 本身亦可形成同二聚體，抑制Bcl-2，從而誘導(dǎo)凋亡。Kovaes等[12]研究表明，在正常子宮肌層中Bcl-2蛋白弱陽(yáng)性表達(dá)，在子宮肌瘤標(biāo)本中Bcl-2 蛋白強(qiáng)陽(yáng)性，而B(niǎo)ax 蛋白在子宮肌瘤標(biāo)本弱陽(yáng)性表達(dá)，在正常子宮肌層中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Wu等[13]和Matsuo等[14]研究證明，Bcl-2/Bax 在子宮肌瘤中明顯高于子宮正常平滑肌，并且在子宮肌瘤中Bcl-2 RNA高表達(dá)，而B(niǎo)ax mRNA低表達(dá)。由此可見(jiàn)Bcl-2/Bax 的異常增高導(dǎo)致肌瘤細(xì)胞的凋亡減少，在子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

總之，本研究顯示羅格列酮促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡。羅格列酮可能通過(guò)上調(diào)PPARγmRNA的表達(dá)，擴(kuò)大了羅格列酮-PPARγ生物學(xué)信號(hào)，從而B(niǎo)ax mRNA被上調(diào)，Bcl-2 mRNA被下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加，因此肌瘤細(xì)胞增殖的減少可能通過(guò)細(xì)胞凋亡的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)的。目前已經(jīng)在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)列酮類藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的非毒性治療作用。因此羅格列酮有望成為子宮肌瘤治療藥或其他腫瘤治療的輔助用藥，PPAR-γ有潛力成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

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(收稿日期:2010-01-05)