p73基因在急性白血病中的表達(dá)及臨床意義

[摘要] 目的 探討p73基因在急性白血病(AL)中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用RT-PCR方法檢測100例初診及復(fù)發(fā)或難治AL患者和20例正常對照者p73基因的表達(dá)，并采用χ2檢驗、t檢驗及單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以比較各組p73基因表達(dá)陽性率及表達(dá)強(qiáng)度差異。結(jié)果 58%的AL患者有較高水平的p73的表達(dá)，初診及復(fù)發(fā)或難治組明顯高于經(jīng)過治療緩解組及正常對照組(P<0.05)。結(jié)論 p73基因表達(dá)在AL的發(fā)病機(jī)制及不良預(yù)后中起了重要的作用。

[關(guān)鍵詞] 急性白血病; p73; 發(fā)病機(jī)制; 預(yù)后

[中圖分類號] R733.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)09-01-03

Expression of p73 Gene in Acute Leukemia and Its Clinical Significance

LI Qianru1# SU Liping2 WU Jianrui3 ZHAO Jin2 SHI Lei4 LI Mingli1 ZHENG Meijing1 DUAN Jingjing1 ZHOU Yongan5*

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China;2.Shanxi Province Tumor Hospital，Taiyuan 030000，China;3.Shanxi Province Children's Hospital，Taiyuan 030000，China;4.The Second Hospital of Shanxi Medcical University，Taiyuan 030000，China;5.Taiyuan Central Hospital，Taiyuan 030000，China

[Abstract] ObjectiveTo study the p73 gene expression in acute leukemia(AL) and its clinical significance. MethodsThe p73 gene ex- pression in 100 cases of AL including newly diagnosed and recrudescent or refractory ones and 20 normal controls was detected by relative quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)，and then the results were analyzed and compared by χ2-test，t-test and single agent variance. ResultsThe higher expression of p73 gene was found in 58% of AL cases. The expression level of p73 gene in newly diagnosed and recrudescent or refractory cases was significantly higher than that of the relief cases after therapy and than that of the controls(P<0.05). ConclusionThe expression of p73 gene plays an important role in the pathogenesis and poor prognosis of AL.

[Key words]Acute leukemia; P73; Pathogenesis; Prognosis

p73基因是1997年由法國的Kaghad等[1]從神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中克隆出來的具有抑癌作用的基因。p73基因是p53基因家族的新成員，具有細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，但是與p53基因在人類腫瘤發(fā)生中經(jīng)常發(fā)生突變不同，至今極少發(fā)現(xiàn)p73有突變，而且p73基因在不同腫瘤中表達(dá)水平差異很大，顯示了抑癌基因和癌基因的雙重特性[2]。我們采用RT-PCR方法檢測了AL患者骨髓單個核細(xì)胞p73 mRNA的表達(dá)，并分析了p73 mRNA表達(dá)與誘導(dǎo)緩解化療的療效及復(fù)發(fā)的關(guān)系，探討p73基因與AL的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2008年6月～2009年3月期間在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院及山西省腫瘤醫(yī)院血液科住院的初治及復(fù)發(fā)或難治急性白血病患者100例，經(jīng)臨床及骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)檢查，按張之南主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]確診。包括初發(fā)未治64例，復(fù)發(fā)或難治36例，按FAB分型，急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)80例(M2 12例，M3 35例，M4 18例，M5 9例，M6 6例)，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)20例。其中男60例，女40例，中位年齡40歲(9~65歲)。對照組為20例非白血病(NL)且骨髓象正常者。

1.2 治療方法

采用ANLL用MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)或DA(柔紅霉素、阿糖胞苷)方案。ALL用VDLD(長春新堿、柔紅霉素、門冬酰胺酶、地塞米松)方案治療。初治及復(fù)發(fā)或難治急性白血病患者采集骨髓液2mL(幼稚細(xì)胞大于50%)，對照組采集外周血2mL，肝素抗凝，分離單個核細(xì)胞，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA的提取與鑒定 用Trizol提取液提取細(xì)胞總RNA，溶于20μLDEPC水中，并鑒定其純度及完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物 p73上游引物:5'-AGCGGAATTCACCACCATCCT-3'，下游引物:5'-CCAGGCTCTTTCAGCTTCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為390bp;β-actin上游引物:5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3'，下游引物:5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為240bp。

1.3.3 cDNA合成 20μL反應(yīng)體系，包括總RNA 2μL，隨機(jī)引物1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶AMV 2U，10mmol/L dNTP 2μL，1.25U/μL RNAi 1μL。反應(yīng)條件:42℃ 60min，94℃ 5min。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 p73、β-actin的cDNA上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL，總反應(yīng)體系20μL。終濃度MgCl2 21.5mM，dNTPs0.2mM，上下游引物各0.4pM，Taq酶1U，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL。反應(yīng)條件:95℃ 3min;94℃ 40s，55℃ 50s，72 ℃ 60s，35個循環(huán);72℃ 10min。

1.3.5 電泳及掃描分析 取2%瓊脂糖凝膠，電泳上述PCR產(chǎn)物20min，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，并測定p73和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶強(qiáng)度的積分值，記錄每例p73/β-actin。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，分別采用χ2檢驗、t檢驗及單因素方差分析對p73 mRNA在AL細(xì)胞及不同細(xì)胞類型中表達(dá)的陽性率及強(qiáng)度結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 p73基因蛋白在AL細(xì)胞及不同細(xì)胞類型中表達(dá)的陽性率及強(qiáng)度比較

見表1、圖1。

2.2 NL組與AL患者組p73 mRNA表達(dá)的比較

患者組p73 mRNA表達(dá)率為49.0%，高于對照組20.0%，兩組表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.68>χ20.05，1=3.84，P<0.05);兩組p73 mRNA表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.13>χ20.05，1= 3.84，P<0.05)。

2.3 ALL組與ANLL組p73 mRNA表達(dá)的比較

p73 mRNA在ANLL細(xì)胞表達(dá)陽性率56.3%，高于ALL細(xì)胞表達(dá)陽性率20.0%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.41>χ20.005，1=7.88，P<0.005);兩組p73 mRNA表達(dá)強(qiáng)度亦有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.25>χ20.05，1=3.84，P<0.05)。

2.4 ANLL組各型之間p73 mRNA表達(dá)的比較

ANLL組按FAB分型分為M2、M3、M4、M5及M6型，無M0、M1及M7型，p73 mRNA在各型表達(dá)率分別為50.0%、51.4%、55.6%、77.8%、66.7%，采用單因素方差分析比較各組陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各組p73 mRNA表達(dá)強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 一般預(yù)后組與不良預(yù)后組p73 mRNA表達(dá)的比較

對接受治療的84例患者隨訪半年以上。根據(jù)對化療的反應(yīng)及復(fù)發(fā)情況分為兩組:(1)一般預(yù)后組:患者經(jīng)誘導(dǎo)治療達(dá)完全緩解(CR)或部分緩解(PR)，均持續(xù)半年以上。共56例，其中ALL16例，ANLL40例。p73 mRNA表達(dá)率分別為75.0%(12/16)及25.0%(10/40)。(2)不良預(yù)后組:患者治療失敗或復(fù)發(fā)共28例，其中ALL4例，ANLL24例。p73 mRNA表達(dá)率分別為25.0%(1/4)及79.2%(19/24)。采用單因素方差分析分別比較ALL及ANLL患者一般預(yù)后組與不良預(yù)后組p73 mRNA表達(dá)率的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);兩組p73 mRNA表達(dá)強(qiáng)度比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

p73基因在AL發(fā)病、不良預(yù)后及治療中的意義:p73基因與經(jīng)典的抑瘤基因p53高度同源，p73基因的過表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長阻滯并誘導(dǎo)其調(diào)亡。約1/3的急性淋巴細(xì)胞白血病和Burkitt淋巴瘤病人的p73基因表達(dá)缺失，但急性髓系白血病病人的p73表達(dá)水平高于正常白細(xì)胞。Corn等[4]、Kawanos[5]等研究表明，p73基因低水平或失表達(dá)在ALL的形成中起促進(jìn)作用。p73基因的失表達(dá)在ALL中是高頻率發(fā)生事件，p73基因在ALL形成中起著抑癌基因作用。

本實驗資料檢測的ALL組p73 mRNA存在較高比例的陰性表達(dá)，達(dá)80%(16/20)，與Liu[6]等研究結(jié)果相似，提示p73基因的失活在小兒ALL的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。亦表明在ALL中p73基因起著抑癌基因樣作用，這與已有研究結(jié)果相似。ANLL組p73 mRNA的表達(dá)初診患者陽性率達(dá)56.3%，明顯高于ALL組20.0%;而通過治療后的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好組p73 mRNA的表達(dá)明顯低于預(yù)后不良組，這表明在急性髓系白血病中p73基因可能不會出現(xiàn)高甲基化而表達(dá)缺失，反而表現(xiàn)為癌基因樣作用。

有研究表明，癌相關(guān)基因(包括p73基因)啟動子高甲基化是ALL的獨立預(yù)后因子[7]，高甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄可能是高甲基化改變了基因構(gòu)型，影響DNA特異序列與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使基因不能轉(zhuǎn)錄，因此p73基因可能是AL中一個新的生物學(xué)預(yù)后因子。Kawano等[5]及Bell等[8]通過相關(guān)研究，提示臨床可以通過檢測ALLp73基因失活與高甲基化程度，利用52AC等去甲基化制劑調(diào)節(jié)p73基因的表達(dá)，相信直接或有選擇地激活p73可用來治療惡性腫瘤。

我們通過研究證實了過度表達(dá)及失表達(dá)與AL的發(fā)病及不良預(yù)后的密切相關(guān)性，ALL組與ANLL組患者初診時及治療后p73基因的表達(dá)情況不同，ALL組初診時表達(dá)陽性率(20.0%)較低，治療后一般預(yù)后組p73基因的表達(dá)陽性率(75.0%)明顯增高;而ANLL組初診時表達(dá)陽性率(56.3%)較高，治療后預(yù)后良好組p73基因的表達(dá)陽性率(25.0%)降低，這表明p73基因在不同類型白血病中表現(xiàn)的作用不同，可表現(xiàn)為抑癌基因或癌基因作用，但本實驗樣本資料較少，還需要進(jìn)一步研究證實。35歲以下成人的惡性腫瘤中白血病所致死亡率居第1位。盡管通過化學(xué)治療或骨髓移植可達(dá)CR，但仍存在感染、出血等危及生命的并發(fā)癥、復(fù)發(fā)及耐藥等問題。相信通過不斷地研究，臨床上即可通過檢測和分析p73基因，為AL的預(yù)后判斷提供有價值的信息，也可為個體化、分子水平的治療——去甲基化治療及基因治療提供依據(jù)，從而為AL提供一種新的治療模式。

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(收稿日期:2009-11-23)