小鼠胚胎干細胞體外誘導分化成GABA能神經元

[摘要]目的探討小鼠胚胎干細胞在體外培養向GABA能神經元定向誘導分化的可能性。方法將小鼠胚胎干細胞以“無血清”方法培養，用DMEM/F12、N2、B27及NT4作為誘導分化劑定向誘導分化，分化好的細胞利用免疫熒光技術、流式細胞技術和RT-PCR鑒定。結果在胚胎干細胞誘導分化成神經元后期，免疫熒光顯示有 GABA能神經元存在;RT-PCR結果證實有GABA能神經元正確分化的重要調控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表達;流式細胞儀計數結果顯示GABA陽性細胞約占總細胞數的(11.49±6.86)%。結論小鼠胚胎干細胞經體外培養可以定向誘導分化成GABA能神經元，可作為神經移植的新來源。

[關鍵詞] 胚胎干細胞; 誘導; 分化; GABA

[中圖分類號] R329.28 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)13-06-02

In Vitro Culture and Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cell to GABAergic Neurons

WU Yang1 GUAN Yunqian2 HOU Hongwei1 WANG Yuping2 YANG Conglin1

1.Department of Neurology，Harbin No.5 Hospital，Harbin 150040，China;2.Department of Neurology，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence，reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons，immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed，RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat，Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition，providing a new source of nerve graft.

[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA

干細胞移植治療中樞神經系統疾病的研究方興未艾，且取得了一定成果，但由于其多取材于胚腦的神經干細胞，為日后臨床應用埋下了倫理道德問題之患，并且受到供體來源短缺的限制[1]。而胚胎干細胞是能在體外培養的高度未分化細胞，具有多潛能性，可以誘導分化成多種組織細胞。如果能穩定的、并且程序化的將胚胎干細胞定向誘導分化成特定類型的神經元，不但可以解決上述問題，還可以使供體細胞對不同神經系統疾病更具靶向性[2]。本文對小鼠胚胎干細胞在體外培養條件下誘導分化成GABA能神經元進行了初步研究，為日后采用源于胚胎干細胞的GABA能神經元移植治療難治性癲癇等神經系統疾病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鼠胚胎干細胞(mESC 系)由宣武醫院細胞中心惠贈。ESC培養基:DMEM，150mL/L ESC專用胎牛血清(Embryonic stem cell specific fetus bovine serum，ES-FBS)，100mmol/L非必須氨基酸，0.55mmol/L β-巰基乙醇、L-谷氨酸、青霉素。使用前添加人類白血病抑制因子(human leukaemia inhibitory factor，hLIF)。ITSFn 篩選培養基[3]:5μg/mL 胰島素(Insulin)，50ng/mL轉鐵蛋白(tran- sferring)，30nmol/L硒酸鈉(Sodium Selenium)，5μg/mL纖維連接蛋白(fibronectin)。增殖培養基:DMEM/F12加入N2、B27及10ng/mL bFGF。分化培養基:DMEM/F12中加入N2、B27及20ng/mL NT4。

1.2 方法

1.2.1 胚胎干細胞的培養及誘導分化 將mESC 1∶5傳代到0.1%明膠鋪底的塑料培養瓶，在使用上述普通ES培養基前添加hLIF，終濃度1000U/mL。用胰蛋白酶將ESC消化成為單細胞，按照2.5×104/cm2接種到低粘附性的細菌培養皿，用撤除LIF的ESC培養基加10%FBS培養4d，細胞由接種時的單細胞長成懸浮的圓形細胞團，即胚胎體(embryonic body，EB)。將消化好的EB接種到新25cm2普通培養瓶，添加無hLIF的ES培養基培養24h，然后用無血清培養基ITSFn培養，連續富集巢蛋白陽性細胞6d。將富集后的細胞消化成為單細胞，按照(1.5～2)×105/cm2的密度接種到新的細胞培養瓶，添加增殖培養基培養，隔日換液，連續培養6d，擴增完畢后用分化培養基培養6d[4，5]。

1.2.2 免疫熒光檢測 分化好的細胞用4%多聚甲醛固定20min，0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3次，0.3%tritonX-100孵育30min。1%BSA(牛血清白蛋白)封閉30min。加入一級抗體，分別是:GABA能細胞標記-小鼠抗小鼠GABA抗體，神經元標記-小鼠抗小鼠Tuj-1(β-tublin-Ⅲ)抗體，星形細胞標記-小鼠抗小鼠GFAP抗體。一抗4℃孵育過夜，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3次，熒光二抗室溫孵育1～2h，熒光標記的二抗為羊抗鼠Cys2、羊抗兔Texas Red。，然后于熒光倒置顯微鏡Nikon 2000-U觀察，SPOT-RT冷卻式數字顯微攝像系統拍照。

1.2.3 流式細胞技術檢測 采用間接免疫熒光標記法，上述方法誘導分化的神經元細胞懸液進行標記，取106細胞加特異的第一抗體，4℃溫度下靜置15～30min。一抗為小鼠抗小鼠GABA抗體。加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標記的第二抗體，4℃靜置30min。緩沖液離心清洗2次后，加入適量緩沖液進行流式細胞儀計數。

1.2.4 RT-PCR檢測 GABA能神經元重要分化調控基因引物(5'至3'排序)[6]:Viaat[572bp](TTCTGTCCTTTTCTCCCGCCCCGCCGCC;GCACCACCTCCCCGTCTTCGTTCTCCTC);Gad1[302bp] (CCTTCGCCTGCAACCTCCTCGAAC;GCGCAGTTTGCTCCTCCCCGTTCTT);Gad2[583bp](ACTCTGGCATTTCTACAAGATGTTATGA;GAATCACACTGTCTGTTCCAATCCCTA)。使用invitrogen試劑盒，反轉錄48℃，45min;預變性94℃，2min;變性94℃，30s;退火58℃，1min;延伸68℃，1min。變性、退火、延伸3個步驟重復40個循環，然后經68℃，10min讓產物充分形成。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測結果

免疫熒光可見，誘導分化后期的細胞中GFAP(封三圖1)、GABA(封三圖2)、Tuj-1(封三圖3)陽性，說明在胚胎干細胞誘導分化階段有GABA能神經元存在。

2.2 流式細胞檢測結果

GABA陽性細胞計數(χ±s):(11.49±6.86)%。流式細胞檢測結果說明在胚胎干細胞誘導分化的神經元后期GABA陽性細胞約占總細胞數的(11.49±6.86)%。

2.3 RT-PCR結果

ESC經過上述誘導分化后，可見與引物相同的PCR擴增條帶，說明有GABA能神經元正確分化的重要調控基因Viaat，Gad1和Gad2基因表達。RT-PCR產物凝膠電泳結果如封三圖4。

3 討論

胚胎干細胞是源于囊胚的內細胞團或者早期胚胎的原始生殖細胞，具有多向分化的潛能以及不斷增殖的能力。目前已經可以從ESC中誘導出神經細胞、心肌細胞、血細胞、肝細胞等[2，7]。對于ESC向神經元的誘導分化有維甲酸誘導法和無血清誘導法，后者具有分階段可調控性和極少胚胎期幼稚細胞的優點[8-9]，故本實驗采取該方法。

ESC向神經元的定向誘導分化的目的之一是為了能夠于移植治療中樞神經系統疾病，而中樞神經系統疾病往往是神經細胞某種特定亞型的減少或者其分泌的某種特定神經遞質的不足，這就需要我們能將ESC向單一類型的神經細胞定向分化、純化，并且能進行大量克隆增殖。其定向誘導分化過程需要不同神經營養因子、轉錄因子、細胞專一蛋白等的參與，這些成分的種類、濃度、比例決定了誘導分化后的細胞的類型[10]。

本實驗嘗試采用DMEM/F12、N2、B27以及NT4作為誘導分化劑，免疫熒光結果表明:有GABA能陽性神經元存在，RT-PCR結果證實有GABA能神經元正確分化的重要調控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表達，說明該方法可以定向誘導分化出GABA能神經元，流式細胞檢測結果顯示GABA能神經元數占總細胞數比例略低于國外文獻報道[6]。

本實驗結果表明，除GABA能神經元外，尚有其他類型的神經細胞，并有少數胚胎期幼稚細胞，GABA能神經元的比例不是很高，提示我們如何對小鼠胚胎干細胞在體外定向誘導分化GABA能神經元進一步調控、去除幼稚細胞、提高GABA能神經元的比例，是我們日后研究的重點。

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(收稿日期:2010-03-06)