PCR技術(shù)在丙型肝炎病毒RNA聚合酶基因分析中的應(yīng)用

[摘要] 目的 研究本地區(qū)HCV病毒分離株的分型，為臨床治療提供依據(jù)。方法 利用PCR技術(shù)克隆并測定NS5B基因片段的核苷酸序列，并對其核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果 克隆的NS5B片段的核苷酸和氨基酸序列與HCV-Ⅱ型代表株相應(yīng)部分序列的同源性最高，而且氨基酸序列比較結(jié)果顯示，37個(gè)分離株中RNA聚合酶結(jié)構(gòu)及其相關(guān)序列無任何變異。結(jié)論 該分離株應(yīng)屬HCV-Ⅱ型。NS5B基因片段可能在病毒復(fù)制中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 丙型肝炎病毒; RNA聚合酶; 基因分析

[中圖分類號] R34 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)07-71-02

The Application of PCR Technology in Hepatitis Virus RNA Polymerase Gene Analysis

SUN An'min

First People's Hospital of Kaifeng，Kaifeng 475000，China

[Abstract] Objectiveand MethodsBy using PCR technology we cloned and determined the nucleotide sequencein the gene fragments of NC5B，and its nucleotide and amino acid sequences were compared. ResultsThe results showed that the cloned NS5B fragments of nucleotide and amino acid sequence nearly have the same character with the corresponding partial sequence in the HVC-Ⅱ type which indicating that should be HVC-Ⅱ type. ConclusionThe result showed that the seven isolated viruses of RNA polymerase structure and its related sequences remained the same without any mutations，hence we suggested this research could play an important role in viral replication.

[Key words]Hepatitis virus; RNA polymerase; Genetic Analysis

丙型肝炎病毒是引起輸血后肝炎的主要病原。1989年美國Chiron公司鑒定并將引起輸血后肝炎的病原命名為丙型肝炎病毒(HCV)以來，人們已基本闡明了HCV的基因組結(jié)構(gòu)。HCV基因組為單股正鏈RNA，全長約9.5kb，包括5'端的結(jié)構(gòu)基因及3'端的非結(jié)構(gòu)基因。分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。基因組非結(jié)構(gòu)區(qū)NS5基因編碼一種NS5B蛋白，該蛋白具有一種賴于RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域(GDD)，提示該蛋白可能與病毒的復(fù)制有關(guān)[1，2]。為了進(jìn)一步研究HCV-RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)與功能，我們克隆了HCV-RNA聚合酶基因并對其序列進(jìn)行了分析?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 引物合成

依據(jù)HCV-BK序列，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增HS5B片斷的巢式引物。外引物 F1:5'-ATGGGCTCCTCATACGGATTCC-3'，R1:5'-TGATGTTATCAGCTCCAAGTCG-3’;內(nèi)引物F2:5'-GGAATTCCGAGTTCCTGGTGAATAGGTGG-3'，R2:5'-CGTCTAGAGCAGTACCTAGTX- ATAGCCTC-3'。在內(nèi)引物的5'端分別加上EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)以利于克隆。引物合成采用381A DNA自動合成儀(Milligen/Biosearch)。

1.2 血清標(biāo)本

37份陽性血清來自本地區(qū)，經(jīng)Abbot第二代HCV檢測試劑測定抗HCV抗體強(qiáng)陽性，用HCV5'非編碼區(qū)引物擴(kuò)增證明為HCV-RNA陽性。

1.3 RNA模板的提取

HCV-RNA的提取采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[3，4]，異硫氰酸胍和焦碳酸二乙脂(DEPC)為Fluka試劑，RNAsin購自華美生物工程公司。

1.4 PCR反應(yīng)

參閱文獻(xiàn)[5]。逆轉(zhuǎn)錄與第一輪PCR反應(yīng)在同一反應(yīng)管中，即在同一PCR緩沖液中進(jìn)行。在完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，選退火溫度42℃反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，以確保擴(kuò)增成功。隨后94℃55s、55℃72min、72℃1.5min再反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。第一輪PCR反應(yīng)完成后，以其產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 cDNA片段的克隆及序列測定

將獲得的cDNA片段克隆至M13mp18/19中，分別從正反兩個(gè)方向測定序列。宿主菌JM103為本室保存，RF型M13mp18/19、限制性內(nèi)切酶購自華美生物工程公司或中國醫(yī)科院基礎(chǔ)所，T4DNA連接酶、WizardTM M13DNA Purification System購自Promega公司。單鏈模板的制備參照使用說明，序列測定采用Tag DNA聚合酶及標(biāo)記的通用引物，在ABI390A全自動序列分析儀上進(jìn)行。

1.6 序列比較分析

將所測cDNA序列與HCV I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型(HCV的基因分型表1)代表序列HCV-l、HCV-J、HCV-J8、HCV-BK、HCV-TW和HCV-CH[6]的相應(yīng)部分進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列比較。核酸分析采用Goldkey軟件。

2 結(jié)果

2.1 cDNA片段的擴(kuò)增

瓊脂糖凝脂電泳結(jié)果顯示，有33份血清擴(kuò)增出預(yù)期大小為454bp的cDNA片段。圖1(單位:bp)是幾例樣品的cDNA片段擴(kuò)增后的電泳結(jié)果。

2.2 cDNA片段的序列測定

將cDNA片段克隆至M13mp18/19中，從正反兩個(gè)方向測定序列，由結(jié)果可知，cDNA片段長454bp，G+C含量為55%，推測氨基酸151個(gè)，經(jīng)與原依據(jù)序列比較，證明為NS5區(qū)的基因片段。

2.3 核苷酸和氨基酸序列比較

將克隆的NS5B片段與I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型代表株HCV-l、HCV-BK、HCV-J6、HCV-J8和中國臺灣株、本地區(qū)株相應(yīng)區(qū)段的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行多序列比較。結(jié)果表明，NS5B基因片段與Ⅱ型序列HCV-BK、HCV-TW和HCV-CH的同源性最高，核苷酸同源性為92.5%～94.4%，氨基酸同源性為94.5%～98.0%;與I、Ⅲ、Ⅳ型代表株的同源性為68.5%～80.9%，氨基酸同源性為73.8%～87.6%，表明本研究中的分離株為HCV-Ⅱ型。NS5B蛋白中的RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域(GDD)及相關(guān)氨基酸序列在比較的7個(gè)不同分離株中高度保守，均未發(fā)生變異。

3 討論

3.1 逆轉(zhuǎn)錄與PCR反應(yīng)

由于丙肝患者的血中RNA滴度較低，所以本研究采用逆轉(zhuǎn)錄與第一輪PCR反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，而且在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，先以低退火溫度反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，第一輪PCR完成后，以其產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物進(jìn)行巢式擴(kuò)增，巢式PCR反應(yīng)的敏感性比第一輪PCR反應(yīng)高10倍左右。在第一輪PCR中先進(jìn)行42℃退火5個(gè)循環(huán)，可有效地提高擴(kuò)增效果。在HCV-RNA陽性血清中可能存在RNA復(fù)制的中間體-負(fù)鏈RNA，將逆轉(zhuǎn)錄與第一輪PCR在同一管中進(jìn)行，由于同時(shí)加入正反向引物，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可同時(shí)雙向進(jìn)行，使cDNA模板量增加，增強(qiáng)了擴(kuò)增效果。此外，逆轉(zhuǎn)錄與第一輪PCR反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，也減少了由于反復(fù)加樣操作污染的可能性。

3.2 核苷酸與氨基酸序列比較

HCV為一高度變異的RNA病毒，不同的分離株其核苷酸和氨基酸序列不同。本實(shí)驗(yàn)克隆的NS5B片段，其核苷酸和氨基酸與HCV-Ⅱ型同源性最高，與Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型同源性較低，表明本研究的分離株屬于HCV-Ⅱ型。本研究的分離株與HCV-CH來源于同一地區(qū)，同為HCV-Ⅱ型，在一定程度上說明本地區(qū)HCV流行株的類型。

HCV雖然高度變異，但某些具有重要功能的氨基酸序列則高度保守，如NS3區(qū)的絲氨酸蛋白酶活性中心和NS5B區(qū)的RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域(GDD)等序列。本研究比較了37個(gè)不同HCV分離株的NS5B基因片段的氨基酸序列，RNA聚合酶中GDD及相關(guān)序列高度保守，預(yù)示該區(qū)可能在病毒的復(fù)制中起重要作用。

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(收稿日期:2009-12-15)