柑橘黃龍病菌侵染九里香不同方法研究

摘要：采用不同的方法將柑橘黃龍病菌傳染到九里香，運用Nested—PCR技術確認九里香是否感染黃龍病菌。結果表明，采用汁液摩擦、注射和擠壓法，接種2個月后不能在幾里香植株體內檢測到黃龍病菌；黃龍病陽性接穗紅江橙嫁接九里香能使黃龍病菌成功侵染九里香，但接穗不能抽芽。草地菟絲子和蟲媒柑橘木虱都能成功從陽性植株體內將黃龍病菌傳播至九里香。柑橘木虱傳“菌”效率結果表明，木虱在紅江橙陽性植株上取食1.5-2h就能攜帶黃龍病菌，病菌從柑橘木虱傳到健康的九里香上最短需要12h，單頭木虱帶菌就能使九里香成功感染黃龍病菌。溫度對病原的傳播效率有較大影響，氣溫高于35℃或低于15℃時，介體昆蟲活力差，傳播病原的效率較低，0℃溫度下木虱幾乎不傳播病原。40℃時昆蟲死亡率高，活力差。

關鍵詞：黃龍病菌；九里香；嫁接；草地菟絲子；柑橘木虱；傳染

中圖分類號：S66 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)02-268-05

柑橘黃龍病是柑橘生產上的一種毀滅性病害。該病主要分布在亞洲和非洲等國家和地區，長期以來，我國廣東、廣西、福建、臺灣等地發病嚴重，經濟損失巨大；江西、浙汀、四川、湖南、貴州、云南等地也有發生。除我國發生外，該病還在南亞、東南亞、非洲東南部、阿拉伯半島等地區流行，2004年巴西柑橘主產區圣保羅洲發現該病，2005年美國佛羅里達洲報道了該病發生。柑橘黃龍病嚴重威脅著世界柑橘產業。黃龍病菌是一種韌皮部桿菌，如今已能成功進行人工培養。可分為3個種：亞洲種其傳媒昆蟲為亞洲柑橘木虱，非洲種其傳媒昆蟲為非洲木虱、美洲種其傳媒昆蟲為亞洲木虱。柑橘黃龍病的傳播途徑主要有嫁接傳播和木虱傳播，木虱是黃龍病菌唯一的蟲媒介體；另外在室內還能通過草地菟絲子傳播。

九里香(Murrara paniculata)為蕓香科(RM-taceae)九里香屬(Murraya)植物，也是黃龍病蟲媒介體柑橘木虱最喜食的植物之一，感染黃龍病后很少表現癥狀，為HLB菌(Cadidatusliberibacter)的隱癥寄主。九里香作為柑橘黃龍病菌的抗性材料有必要對其做進一步的研究，在本實驗所要解決的問題就是尋找讓九里香快速感染黃龍病菌的途徑以及最佳途徑的效率測定。研究結果可為下一步從九里香上大規模篩選抗黃龍病相關基因奠定基礎，并為柑橘木虱和黃龍病的發生和防治提供有價值的參考。

1、材料和方法

1.1材料

2008年10月從廣東龍門市的果園收集具有典型黃龍病癥狀的柑橘枝條，選取經PCR檢測為陽性的枝條嫁接在健康紅江橙的實生苗上，置于廣東省農業科學院果樹研究所的日光溫室內培養3個月以上，翌年元月再次檢測嫁接紅江橙的材料，確定為柑橘黃龍病菌亞洲種侵染的陽性材料，并作為柑橘木虱的取食來源。九里香材料：2009年2月采自廣州市綠化道上的九里香的種子，用無菌土栽培，苗高10cm后作為實驗材料。昆蟲介體：柑橘木虱雌雄蟲采自于廣州市內九里香，成蟲在防蟲網室內培養后交配產卵、孵化后的1齡若蟲即為無黃龍病菌的柑橘木虱，若蟲轉移到無病原感染的九里香苗上。4齡以上的若蟲置于陽性植株上飼養20d后即為帶黃龍病菌的柑橘木虱。田野菟絲子于2009年3月下旬采自于廣東東莞，采用藤莖繁殖方法保存于溫室里帶黃龍病菌的陽性材料上。所有的接種實驗均在溫室里進行。

1.2不同傳染方式的比較

1.2.1針刺、摩擦接種和擠壓法

在氣溫為25℃左右的環境下進行。針刺：用微型注射器將含黃龍病菌的磷酸鹽緩沖液注入九里香幼苗莖和葉，以不含病菌的緩沖液為對照。摩擦接種：取市售的砂紙，分成等份小塊，對折形成棱，用砂紙的棱蘸取接種液在接種植株葉片上輕輕從棱的一端劃到另一端。擠壓：注射器的針筒裝入黃龍病菌的磷酸鹽緩沖液，然后直接按壓葉片(不用針頭)。2-3個月后用Nest-PCR進行檢測。以下的檢測方法均采用同樣的方法。

1.2.2嫁接傳染在氣溫為20℃左右的環境下進行。方法一：采用腹芽嫁接法和劈接法將1a生陽性枝條嫁接到2a生健康九里香實生苗上，或將接穗削成長方形貼在九里香的莖桿上。處理5株植株，接穗總數為30個。方法二：幼苗和2a生的實生苗與陽性材料進行靠接，盡量增大接合面的面積，處理5株植株。觀察接穗的存活情況，對接穗保持綠色的植株進行取樣。在溫度高于25℃再進行1次重復嫁接，每10d取樣1次進行檢測。

1.2.3菟絲子傳播在氣溫為20℃左右的環境下進行。菟絲子成功寄生九里香后，人工輔助菟絲子的莖纏繞陽性材料上。每10d取樣1次進行檢測。

1.2.4柑橘木虱傳播將供試帶黃龍病菌的柑橘木虱禁食2h饑餓處理后轉移到健康的九里香實生苗上處理1-2周。取九里香樣品進行檢測。

1.3柑橘木虱傳毒效率的測定

1.3.1獲菌時間測定為獲得柑橘木虱更準確的傳菌獲菌時間，在接種方法中初步測出傳菌時間的基礎上進一步進行柑橘木虱的傳菌效率準確測定。在氣溫為25℃左右的環境下進行。將供試無黃龍病菌的柑橘木虱禁食2h饑餓處理后，在陽性樣品上進行取食，時間為0.5、1、1.5、2、3、4、5h，每個處理進行3次重復，每株接蟲5頭。處理完畢后移走柑橘木虱，九里香植株在溫室內放置2周，收集材料，備檢測用。

1.3.2傳菌時間測定將供試帶黃龍病菌的柑橘木虱禁食2h饑餓處理后至健康九里香幼苗上進行飼養，時間分別為6、12、24、48、72h，每個處理進行3次重復，每株接蟲5頭。處理完畢后移走柑橘木虱，將不同處理的九里香植株在溫室放置2周，收集材料，備檢測用。

1.3.3傳菌效率測定將供試帶黃龍病菌的柑橘木虱禁食2h饑餓處理后，置于健康九里香實生幼苗上處理3d，接蟲頭數分別為1頭、3頭、5頭、7頭，共4個處理，每個處理重復3次，處理完畢后移走柑橘木虱，將不同處理的九里香植株在溫室放置2周，收集材料，備檢測用。

1.3.4溫度對傳菌的影響將供試帶黃龍病菌的柑橘木虱禁食2h饑餓處理后轉移至健康九里香上分別進行飼養，處理的溫度分別為0℃、4℃、10℃、17℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃每個處理進行3次重復，每株接蟲5頭。將不同處理的九里香植株在不同溫室條件下放置2周，收集材料，備檢測用。

1.4PCR檢測

根據丁芳等報道，依據黃龍病菌16SrDNA的序列設計特異巢式引物序列，由上海生物工程有限公司合成。外側引物5’-TGAATTCTFCGA GGTTG-GTGAGC-3.5’-AGAATTCGACTrAATCCCCACCT-3’，內側引物，5’-GAGTTCATGTAGAAGTYGTG-3，下游引物5’-CCTACAGGTGGCTGACTCAT-3’。用第1輪的產物稀釋20倍后作為第2輪擴增的模板，PCR體系為：10×PCR緩沖液2.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.5μL，引物P1/P2(10μmol·L^-1)1μL，DNA模板1-2μg2.5μL，Tag聚合酶(鼎國)0.5μL，加雙蒸滅菌水定容至25μL，電泳檢測中使用的Maker購自北京鼎國生物公司。

2、結果與分析

2.1不同傳染方法比較

經Nest-PCR檢測結果發現，采用注射、汁液摩擦和擠壓的方法接種2-3個月后檢測，結果均未檢測出病原菌，說明采用機械的方法無法使九里香感染黃龍病菌。采用嫁接法進行感染時，8個紅江橙接穗在九里香上能在2-4個月的時間內保持綠色，其中2個貼接的接穗能保持到半年以上。溫度高于25℃時。嫁接的紅江橙成活率大大降低，僅有2個紅江橙接穗保持活力2個月左右。九里香幼苗與紅江橙靠接時，2株接合面能夠融合。接穗在九里香上均不能發芽。對收集的嫁接材料進行帶菌情況檢測，結果顯示2種嫁接方法均能使九里香感染黃龍病菌，Nest-PCR能檢測到病原的時間為60d左右，田野菟絲子在2種木本寄主上成功寄生需要7d左右。在九里香上能檢測到病原的時間約80d左右(圖版-A-c)。初步檢測柑橘木虱取食1周后的九里香植株，運用Nest-PCR方法能檢測出黃龍病菌的存在(圖1)。對以上幾種病原傳染方式進行比較可知，在九里香上進行病菌汁液摩擦接種難以成功，遠源嫁接和菟絲子傳播能使九里香感染黃龍病菌，柑橘木虱的傳菌效率最快。

2.2柑橘木虱傳菌效率測定

在初步檢測柑橘木虱帶菌的情況后對柑橘木虱傳菌效率進行檢測，結果表明，未帶黃龍病菌的柑橘木虱在陽性紅江橙樣品上取食1.5-2h后體內就能帶上黃龍病菌。從帶柑橘黃龍病菌木虱傳菌到健康九里香上至少需要12h，傳菌柑橘木虱的數量需求少，單頭木虱即可成功傳菌。溫度對病原的傳播效率有很大影響，氣溫高于35℃或低于15℃時，介體昆蟲活力差，傳菌效率也大受影響，4℃溫度左右木虱幾乎不傳菌，40℃時木虱死亡率高，活力差(圖2)。

3、討論

九里香感染黃龍病菌研究中采用注射、汁液摩擦和擠壓的方法均不能感染病原，一方面可能由于接種的環境破壞了病原物生存環境，另一方面可能是因為九里香屬于木本植物，增加了感染病原的難度。關于利用菟絲子傳播黃龍病的方式早在上世紀80年代柯穗就報道利用草地菟絲子成功的將黃龍病菌從柑橘傳到長春花上。本實驗在室內利用菟絲子將黃龍病菌從柑橘傳到九里香上提高了病原傳播的成功率，但這種傳播病原的方式耗費的時間長。這可能是與病原在植株體內的運輸方式和菟絲子的自身的寄生特性有關。柑橘和九里香之間嫁接，嫁接枝芽不發芽，但接穗能保持活力較長時間，這種情況下就增加九里香感染上黃龍病菌的機會。嫁接的方式同菟絲子傳播方式一樣，耗費的時間長。柑橘木虱是傳播黃龍病菌的唯一蟲媒介體，也是黃龍病傳播主要方式。通過實驗發現，木虱傳菌是所選用的幾種途徑中效率最快的一種途徑，實驗中通過縮短柑橘木虱在九里香上的取食時間，處理后在移走柑橘木虱，然后將植株培養2周再用Nest-PCR檢測，結果表明，帶菌的柑橘木虱在九里香取食就有機會傳病，時間短，與Ghosh等和李韜等報道的實驗結果接近。柑橘木虱在黃龍病菌寄主體內分布不均勻，木虱獲菌幾率與取食寄主部位有關，在有病原的部位取食感染病原的時間可能會更短，如延長在病樹上取食的時間可能增加帶菌機會。傳菌效率測定為黃龍病菌侵染九里香發病初期的確定提供了依據。

溫度是影響柑橘木虱活力的主要因素，本實驗中也初步證明了病原的傳播與溫度相關。高溫情況下柑橘木虱體內的新陳代謝紊亂，導致蟲體死亡。低溫條件下處于休眠狀態，幾乎不取食，病原傳播的幾率也很低。在大田環境中，例如我國的南部地區，溫度和濕度都非常適合柑橘木虱和寄主植物的生長，增加了寄主植物感染黃龍病的機會，所以黃龍病在南方一些地區全年發病和傳播。在氣溫低的條件下，柑橘木虱處于越冬期，病原也處于不活動狀態，病原傳播的幾率也大大降低，在冬季溫度低于0℃的地區，柑橘木虱很難越冬，昆蟲介體難以成為柑橘黃龍病流行的主要因素。所以柑橘黃龍病在我國的南部自然傳播非常流行，中北部的地區柑橘黃龍病并不流行。

黃龍病的發生與很多因素相關，受昆蟲介體與嫁接操作的影響較大，有關黃龍病發生規律與柑橘木虱及寄主之間的關系需要進一步研究。

4、結論

摩擦、注射、擠壓等機械法不能成功將黃龍病菌傳播至九里香。遠緣嫁接、菟絲子傳播和蟲媒柑橘木虱幾種方法能成功傳播黃龍病菌到九里香。蟲媒柑橘木虱傳播的方法效率最高，柑橘木虱在陽性植株上取食1.5-2h就能攜帶黃龍病菌，病原從柑橘木虱傳到健康的九里香上最短需要12h，單頭木虱帶菌就能使九里香感染黃龍病菌。溫度對病原的傳播效率有較大影響，高溫和低溫均不能傳播病原。