不同發育時期椰子葉片精油的提取與成分分析

摘要：為明確引誘椰心葉甲取食的化學信息物質，利用同時蒸餾萃取法分別提取椰子的心葉、半展葉、老熟葉的精油，并采用氣相色譜一質譜聯用法對3者化學成分進行種類和含量的比較分析。結果表明，不同發育時期椰子葉片精油的主要成分為：2.3一二氫苯并呋喃、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2.6一二叔丁基-4-甲基苯酚、十四烷酸、棕櫚酸、葉綠醇、浦酸和(z，z)-9，12-十八碳二烯酸等，這些化合物分別占椰子心葉、半展葉、老熟葉總精油含量的83.16％、67-23％、68.17％，但各成分在其含量上存在明顯差異，這可能導致了它們對椰心葉甲的活性差異，本研究為初步確定椰子心葉對椰心葉甲的引誘活性成分提供了理論依據。

關鍵詞：椰子葉片；精油；同時蒸餾萃取；氣相色譜-質譜聯用

中圖分類號：S667.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)02-246-06

椰子屬棕櫚科椰子屬，為多年生熱帶木本油料作物，在我國主要分布于海南、臺灣、廣東、廣西等地，栽培面積、產量及品質等均以海南為最，是海南省的特色水果。椰子是一種優質的農產品，既是果品又是油料，將椰子的整個可食部分與非可食部分開發利用。可獲得很好的經濟效益。

椰心葉甲是我國進境植物檢疫的二類危險性害蟲，原產于印度尼西亞與巴布亞新幾內亞，現廣泛分布于太平洋群島及東南亞地區。在我國南部，特別在海南省，椰心葉甲成為棕櫚科植物重要的害蟲，特別對椰子樹危害尤為突出。其主要危害寄主最幼嫩的心葉部分，幼蟲、成蟲均群棲潛藏于卷折的心葉內，嚙食卷葉表皮薄壁組織，受害心葉呈現失水現象，新葉抽出伸展后為枯黃狀，嚴重時頂部葉片均呈現火燎焦枯，引起心葉枯死，造成植株死亡。椰子樹是海南獨特的森林資源，椰心葉甲的危害，不但對生態景觀造成破壞，還給海南的農業和旅游方面造成很大經濟損失。目前對椰心葉甲的防治方法主要有殺蟲劑防治和利用寄生蜂、綠僵菌等微生物防治。由于椰心葉甲主要為害椰子的心葉部分，對半展葉和老葉的危害次之，因此本文分析了椰子心葉、半展葉、老熟葉的揮發物質的成分，以期找到寄主心葉揮發物中對取食期椰心葉甲具有引誘活性的化學物質成分，以便更有效地防治椰心葉甲。

同時蒸餾萃取法(SDE)是Likens等在1966年改進發展起來的一種植物易揮發成分提取法，該法通過同時加熱樣品液相與有機溶劑至沸騰來實現，將水蒸汽蒸餾和餾出液的溶劑萃取兩步合二為一，結果蒸餾和提取同時進行，只需要少量溶劑就可提取大量樣品。揮發性成分得到濃縮。由于SDE法所獲得的是精油在有機溶劑中的溶液，體積較大，便于操作，避免了通常蒸餾法提取精油時在器壁上吸附損失及轉移微量精油時的操作困難。SDE法應用于揮發性成分提取分析在國內外已有較多報道，但迄今為止，尚未見應用于椰子葉片精油提取的報道。我們采用同時蒸餾萃取裝置對不同發育時期椰子葉片精油進行提取，并用氣相色譜一質譜聯用儀對其成分進行分析比較，旨在找出心葉精油中特有成分，以期為探索誘導椰心葉甲取食的趨性物質提供科學依據。

1、材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

椰子心葉、半展葉、老熟葉(于同一批椰樹的不同發育時期進行取樣)采集于海南儋州西慶農場。

二次去離子水；無水乙醚(使用前重蒸處理)、無水硫酸鈉(120℃烘箱加熱2h)均為分析純試劑(廣州化學試劑有限公司)。

同時蒸餾萃取裝置(SDE)(廣州芊薈化玻儀器廠)；氣相色譜一質譜聯用儀(GC-MS)(德國Finniga公司，Finnigan TRACE GC-MS)；RE-52A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2精油的提取

分別選取不同發育時期的椰子葉片用去離子水洗凈、晾干表面水分，將其剪成約2cm×2cm的小段，稱取200g置于2000mL圓底燒瓶中，加入800mL二次去離子水，連接到同時蒸餾萃取裝置的一端，于電熱套上加熱保持微沸。另一端連接盛有60mL重蒸乙醚的250mL平底燒瓶，置45-48℃水浴中加熱。同時蒸餾萃取3h后，去掉水層，收集乙醚層，向萃取液中加入5g無水硫酸鈉除去水分，置-20℃冰箱冷藏備用。另取同樣質量的相同葉片重復以上步驟，合并2次乙醚層收集液，置于-20℃冰箱中過夜，趁冷過濾除去無水硫酸鈉，最后將濾液經旋轉蒸發減壓濃縮至2.0mL淡黃色液體，取0.3μL進行GC-MS分析。

1.3儀器分析條件

1.3.1色譜條件環境條件：室溫20℃，相對濕度60％；毛細管柱：DB-130mx0.25mm；升溫程序：45℃保持2min，以5℃·min^-1升至80℃保持2min，以10℃·min^-1升至180℃保持5min，再以10℃，min^-1升至終溫250℃

進樣口溫度：250℃；載氣：He，流速1.0mL·min^-1：進樣量：0.3μL；分流比：20：1

1.3.2質譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量：70eV；質量掃描范圍m/z：35-335amu；傳輸線溫度：250℃；離子源溫度：250℃；MS譜庫：NIST庫。

1.4分析方法

樣品經GC-MS分析，對采集到的質譜圖用NIST、Willey檢索譜庫對精油組分進行進行檢索定性，采用色譜峰面積歸一化法測定樣品中各組分的相對含量。

2、結果與分析

2.1不同發育時期椰子葉片精油的成分分析與比較

對不同發育時期椰子葉片的精油進行GC-MS化學成分檢測，椰子心葉、半展葉、老熟葉精油的總離子流程圖如圖1-3所示。

采用相應質譜圖計算機檢索的方法對椰子心葉、半展葉、老熟葉精油進行檢索，共檢測出90種成分，用面積歸一法計算它們的相對含量，各化合物按出峰時間先后進行排列，結果見表1。

由表1可以看出，椰子心葉、半展葉、老熟葉精油的化學組成是不完全相同的，并且對于相同化合物其在含量上也存在很大差異。從椰子心葉精油中共鑒定出33種化合物，明顯少于半展葉(47種)和成熟老葉(60種)。3種不同發育時期的椰子葉片精油共有主要成分16種：2.3-二氫苯并呋喃、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2.6-二叔丁基4-甲基苯酚、十四烷酸、棕櫚酸、葉綠醇、(Z，Z)-9.12-十八碳二烯酸、油酸、十二烷、二十二烷、新植二烯、十四烷-1-醇、壬醛、棕櫚醛、癸醛和十四烷醛，這些化合物分別占各自精油含量的83.16％、67.23％、68.17％。其中心葉特有成分8種：十八烷、姜烯、á-紅沒藥烯、β-倍半水芹烯、十三烷1-醇、3，7，11-三甲基十二烷-1-醇、十七烷-1-醇和2-甲基琥珀酸，占其總量的4.38％。半展葉和成熟老葉精油中有許多心葉所沒有的成分，如：1-辛醇、十七烷-2-酮、癸酸、十五烷酸、(z)-11-十六碳烯酸等。

2.2不同發育時期椰子葉片精油成分的種類比較

從圖4可以看出，不同發育時期椰子葉片的主要精油成分中各成分種類多樣，相對含量也有較大差異。其中酸類在各發育時期葉片精油中含量最大，其含量分別為(按心葉、半展葉、老熟葉順序列出)27.33％、43.09％、21.44％。其次，酚類、醇類和雜環類在各時期葉片精油中也占有較大比重。此外，半展葉精油中的醛類含量(6.95％)明顯高于心葉和老葉中的含量，而老葉精油中的烴類含量(14.43％)又顯著高于心葉和半展葉，酮類在半展葉和老葉精油中的含量(4.41％、6.85％)又遠大于心葉中的含量(0.11％)，而酯類在在各時期葉片精油中的含量普遍較少，且呈減少趨勢(1.75％、1.24％、0.64％)。

3、討論

本試驗采用同時蒸餾萃取裝置提取了椰子葉片不同發育時期揮發性物質，然后經氣相色譜一質譜聯用技術對揮發性成分進行分離鑒定，并對其成分及含量進行了對比分析。通過分析發現，隨著葉片的生長，其揮發性物質在種類和含量上都發生了較大的變化。導致這些變化的原因是多樣的，可能是在成長過程中植物自身發生的一些代謝反應引起的，如植物在受到病蟲害時候自身也能產生一些化合物來提高抵抗和免疫的能力，在受到外界損傷如大風、動物或人類的破壞時植物也能產生一些化學物質來提高適應能力。此外植物性精油隨著土壤成分、氣候條件、生長季節、生成年齡、采集時間、儲運情況、提取方法、檢測方法等不同，組分與含量也會有一定差異。心葉精油中的成分姜烯、a-紅沒藥烯、β-倍半水芹烯、十三烷-1-醇、3，7，11-三甲基十二烷-1-醇、十七烷-1-醇和2一甲基琥珀酸等是半展葉和老葉中所沒有的，推測它們極有可能為引誘椰心葉甲的活性成分，進一步分離得到這些化合物并對其進行生物活性測定。并對這些活性化合物進行結構與活性的關系研究，從中篩選出一些高效且結構比較簡單的活性化合物或其衍生物并將其作為模板，用來合成、修飾或改造，創制新型高效生物農藥，對于椰心葉甲的有效防治和開發環境和諧農藥將具有重要的理論和實踐意義。