菠蘿微衛星指紋圖譜的構建

摘要：初步構建了菠蘿種質的SSR指紋圖譜，為菠蘿種質鑒定提供了依據。從菠蘿EST－SSR開發的20對微衛星引物擴增31份不同的菠蘿種質，篩選出能夠穩定擴增且帶型差異明顯的SSR引物。挑選5對多態性高、分辨率高、重復性好的SSR引物對，作為標準引物對材料進行擴增。每對引物得到的多態性帶數8－15個，平均為11條；引物的多態信息含量(PIC)在0.6437-0.7928，平均0.7373。依據帶型特征，建立菠蘿DNA分子指紋圖譜。

關鍵詞：菠蘿；SSR；指紋圖譜

中圖分類號：S668.3 文獻標識碼：A 文章編號；1009-9980(2011)02-240-06

菠蘿屬菠蘿科、鳳梨屬，原產南美洲巴西和巴拉圭，在熱帶和亞熱帶地區均有分布。菠蘿最早由印第安人傳至中南美洲和西印度群島，自哥倫布從瓜德羅普島帶至西班牙之后，在世界各地推廣，覆蓋全球70多個國家和地區。菠蘿在熱帶水果生產和貿易中的地位僅次于香蕉和芒果，是中南美洲和亞太地區的重要經濟作物之一。

在菠蘿的栽培及傳播過程中，由于傳播者及當地栽培者的習慣命名不同，各品種的別名特別多，出現了異名或多名的現象，造成了菠蘿品種名稱混亂的現象，而且各大類群品種的變異性大，這不但阻礙了菠蘿種質資源的合理利用，也影響了菠蘿的品種改良與育種。

DNA指紋圖譜是指建立在DNA標記基礎上的某一品種所具有的區別于其他品種的特異DNA片段。DNA分子標記繪制的品種指紋圖譜像人的指紋一樣具有個體特異性，能準確、快速鑒定品種或品系，簡化了作物育種和種子管理工作。通過圖譜可表現與目標性狀有關的DNA水平的信息，避免了環境干擾；不受生長發育時間的制約；準確可靠；特別適合從形態上較難鑒定的品種。通過檢測待測樣品是否具有目標品種特有的指紋片段及其比例，可以有效地鑒定種子的純度、品種的真偽，對種子質量進行監測。另外，通過DNA指紋的比較可以方便地提供分子水平的直接證據，有利于品種或材料獲得專利保護。

微衛星分子標記是近些年發展起來的建立在PCR擴增基礎上的分子遺傳標記，已被廣泛用于玉米、水稻、大豆、小麥等農作物DNA指紋圖譜的構建及雜交種子純度鑒定研究中。國內外有利用AFLP、ISSR、RAPD、RFLP等分子標記技術對菠蘿進行研究的報道，但SSR分子標記技術的應用鮮見報道。

我們利用自主開發的5對SSR引物構建了31份菠蘿種質的SSR指紋圖譜，初步建立了一套適用于菠蘿種質鑒定的SSR技術體系，旨在為菠蘿新品種的登記、分類和保護奠定分子基礎。

1、材料和方法

1.1材料

材料來源于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所和中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，菠蘿種質圃所保存的種質(表1)。取田間生長健壯、無病蟲危害植株的幼嫩葉片，保存于-70℃備用。

1.2 DNA提取

DNA提取采用改良的CTAB法，程序簡介如下：取約1g樣品，在液氮中研磨成粉末；加5mLCTAB提取緩沖液[100mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)，5mmol·L^2--1EDTA-Na₂，0.35mol·L^-1葡萄糖，2％PVP40，用前加入3％β-巰基乙醇]，離心后棄去上清；加入5mL65℃預熱CTAB裂解緩沖液[100mmol·L^-1。Tris-HCl(pH8.0)，20mmol·L^-1EDTA-Na₂，1.4mol·L^-1NaCl，2％CTAB，2％PVP40，用前加入3％3-巰基乙醇]，搖勻，65℃水浴30-90min；加等體積氯仿：異戊醇(24：1)抽提；上清液用0.6倍體積的異丙醇和1/10體積3mol·L^-1乙酸鈉(pH5.2)沉淀DNA；用無離子水稀釋DNA之后用酚：氯仿：異戊醇(體積比為25：24：1)和氯仿：異戊醇(體積比為24：1)抽提純化；最后用2倍體積預冷無水乙醇沉淀DNA，用TE溶解。所有沉淀都經70％乙醇清洗2-3次。

1.3PCR擴增和電泳檢測

PCR擴增反應體系的總體積為20μL包括：2μL的10×PCR buffer，1.6μL的1.5mmol·L^-1MgCl₂，0.25mmol·L^-1dNTPs，5pmol正、反向引物各1μL，20ng模板DNA，0.15U Tag(5U·μL^-1)；反應程序為：94℃預變性3min，30個循環(94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min)，72℃延伸7min。PCR產物的分離用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，1×TBE電泳緩沖液120V恒壓電泳1.5h，電泳完畢采用銀染顯色、檢測。觀察并照相記錄。

1.4指紋圖譜的構建

借鑒小麥帶型記錄的新方法，根據每對SSR引物生成帶型間的差別直接對帶型進行分類編號，可得到每個品種在相應的引物擴增時帶型編號，一個品種的DNA經過不同引物擴增后、將獲得一系列帶型編號，按照固定的引物順序，串聯各帶型編號形成一組數據，便是該品種的分子指紋圖譜。

2、結果與分析

2.1指紋圖譜

2.1.1SSR標準引物篩選應用前期開發的20對菠蘿EST-SSR引物，篩選能夠擴增出穩定帶型且不同材料之間差異明顯的SSR引物，從中選取5對多態性高、分辨率高、重復性好的SSR引物作為標準引物(表2)，用于構建31份菠蘿材料的DNA指紋圖譜。

2.1.2標準帶譜的建立SSR帶型識別和記錄過程中，常因帶紋繁多、分布復雜而造成判讀和記錄困難。本試驗借鑒小麥SSR帶型記錄的快捷方法——以帶型間的差別直接進行編號，從而簡化帶型的識別和記錄。該方法避免了由于錯誤判斷引起的試驗誤差，并可利用每個品種的帶型編號，建立品種(系)的DNA指紋。將5對引物依次用英文字母A，B，C，D，E表示，每對引物生成的有差別的帶型則用該引物的字母代號和一串阿拉伯數字組合記錄。5對引物EP-12，13，15，20和24按帶型差異可分別將31份供試材料分為6，7，7，7和6組，圖1所示為引物對EP-12的31份材料擴增圖譜，圖2為引物對EP-12的標準帶型圖譜。

2.1.3標準圖譜的構建將每對引物分別在31份種質中擴增出的帶型與該引物的標準帶譜進行比較歸類，這樣每個品種將會有5個英文字母和阿拉伯數字組成的代碼，即是該品種的分子指紋圖譜(表3)。部分品種分子指紋圖譜見圖3。

2.2菠蘿材料的SSR分析

所篩選的5對引物均能夠在供試材料中擴增出穩定特異條帶，每對引物可以檢測到多態性條帶8－15個，平均11個，引物的多態信息含量(PIC)為0.6437-0.7928，平均0.7373。對擴增結果進行分析，發現每對引物都不能單獨將所有供試材料完全區分開，只能將材料區分為6-7組。其中有4對引物在擴增時具有特征帶譜；分別為EP-13的金菠蘿；EP-15的Puket、紅西班牙；EP-20的日本菠蘿、臺農十八號、紅西班牙：EP-24的紅西班牙。

把5對引物分別進行2對或3對組合后發現，任2對引物組合都不能將所有供試材料區分開。引物EP-13和EP-15引物組合后，發現能區分17份材料，加上EP-20后其余均能區分開。其他任意3對組合均不能將31份材料完全區分開。

3、討論

3.1菠蘿微衛星指紋圖譜的初步建立

指紋圖譜的構建采用了王立新等記錄小麥SSR帶型的方法，而不是傳統的用1和0數據記錄每條帶紋，此種方法的優點是，一、適用于帶型種類多、每種帶型的帶紋數目多、帶紋分布不均勻的材料。二、它是針對每種帶型賦予不同的編號以示區別，在確定待測品種某SSR位點的帶型時，將待測品種的SSR帶型與該引物標準帶型可在同一塊膠上電泳，進行比對，便可確定待測品種的帶型編號，增加引物數量或實驗材料，有可能會增加不同的帶型，這樣可以繼續用英文字母和阿拉伯數字表示增加的引物和帶型，不影響以前記錄的結果，方便易行㈣。

3.2微衛星標記的選擇

優良品種是作物獲得高產的基礎，而品種混雜和純度降低會明顯降低產量，快速準確地鑒定品種和進行純度分析，對于種子質量標準化、品種審定、種性辨別、產權保護均有重要作用。種質資源的遺傳多樣性及親緣關系信息是育種工作的基礎，對優良品種的遺傳多樣性進行準確的評價可以為親本選配、后代遺傳變異程度及雜種優勢水平的預測提供預見性指導，這是育種目標能否成功實現的關鍵。

目前菠蘿的分類方法仍存在一些問題，如分類標準難以統一、分類結果不一致；地區及國際間的種質頻繁交流而導致同名異物、同物異名現象存在，造成了菠蘿品種名稱混亂的現象，而且各大類群品種的變異性大，這不但阻礙了菠蘿種質資源的合理利用，也影響了菠蘿品種的改良與育種。關于菠蘿種質分析的研究情況，在國外有少數應用RFLP、RAPD對菠蘿種質資源分類的報道，如M.F.Duval等應用RFLP技術對菠蘿種質資源進行多樣性研究。有研究應用RAPD分子標記對18份菠蘿種質進行了分子評價，得出供試菠蘿栽培種的相似系數在0.85以內。Sergio feuser等應用RAPD對菠蘿種質進行了分子評價。而菠蘿SSR標記的相關研究報道卻很少。

與其他標記RAPD，RFLP及AFLP相比，以微衛星序列為基礎的SSR標記在DNA指紋庫構建上顯示了獨特的優越性。SSR標記數量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態性高；具有復等位基因的特性，提供的信息量大；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；每個位點由設計的引物序列決定。便于不同實驗室相互交流合作開發引物，獲得的資料能夠在不同實驗室重復并共享。

4、結論

利用微衛星標記，借鑒小麥SSR帶型記錄的快捷方法，構建了31份菠蘿種質的DNA指紋圖譜，初步建立了一套適用于菠蘿種質鑒定的SSR技術體系，旨在為菠蘿新品種的登記、分類和保護奠定分子基礎。