紅肉臍橙等5個柑橘品種氣孔器結構的比較研究

摘要：以卡拉卡拉紅肉臍橙、玫瑰橙、稻葉溫州蜜柑、春見和HB柚等的春梢嫩葉(1/2伸展)與完全伸展葉片為材料，結合常規石蠟切片、超薄切片與透射電鏡技術、掃描電鏡技術以及改良的臨時裝片法，對3種柑橘屬植物5個品種葉片的顯微結構及氣孔器進行了觀察，并運用氣孔器長度、寬度，副衛細胞數目等變量對氣孔器進行了聚類分析。結果表明，參試柑橘品種葉片氣孔主要分布在下表皮，在上表皮中僅在中脈附近呈帶狀分布：參試品種的氣孔結構基本類似，氣孔橫切面呈“漏斗”狀，內開口決定氣孔的開張程度；5個品種的氣孔器均可以明顯地分為2種類型(Ⅰ-型與Ⅱ-型)，2類氣孔器在氣孔外開口長度與寬度、氣孔內開口長度與寬度、氣孔器大小以及副衛細胞的數目方面均存在顯著差異，并且2者的分化時期與發育命運各不相同；橙類葉片發育后期Ⅰ-型氣孔器的退化可能與其抗病性的提高有關。

關鍵詞：柑橘；氣孔器；保衛細胞；副衛細胞；分類

中圖分類號：S666.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)02-193-06

氣孔是植物與外界環境進行氣體、水分交換的通道，與光合作用、呼吸作用和蒸騰作用關系密切。植物的氣孔密度、大小及開閉規律與其對環境的適應性、抗性有密切的關系。也是種質資源評價中重要的植物學性狀之一。

目前，國內外系統研究柑橘葉片氣孔的報道甚少，研究柑橘類植物氣孔的方法主要有煮沸撕取法和掃描電鏡法。柑橘類植物的葉片質地結構緊密，采用撕取法操作難度大、效率極低，而幼嫩葉片細胞經解離后變得松散無法撕取下表皮，因而煮沸撕取法很難取得成功；此外，柑橘類植物葉片表面具有蠟質，采用透明膠帶黏取法無法撕取下表皮；印跡法程序復雜，且不易制片成功；而掃描電鏡法對儀器設備要求高，從而影響了柑橘類植物氣孔的研究。

研究表明，柑橘潰瘍病病原菌主要通過氣孔和機械傷口進入植物組織，進而引起一系列的病理反應。李潤唐等在對30個柑橘類植物氣孔研究中發現，柑橘氣孔口存在內脊。溫壽星等在對幾個柑橘品種的葉片結構與柑橘潰瘍病抗性的初步研究后推測氣孔的內部構造可能與品種的抗性有關。但限于上述研究方法存在的各種弊端，目前未見有柑橘氣孔內部構造的深入研究報道。因此，探究適合柑橘類植物的表皮與氣孔的簡易觀察方法，系統深入研究柑橘類植物的氣孔器結構，是柑橘植物學研究中的一項重要內容，對柑橘類植物的抗逆性機制研究及品種定向選育具有重要意義。

1、材料和方法

1.1材料

試驗材料為卡拉卡拉紅肉臍橙、玫瑰橙、稻葉溫州蜜柑、春見和HB柚等5個柑橘品種春梢嫩葉(1/2伸展)與完全伸展(未完全轉綠)葉片，取自福建省農業科學院果樹研究所柑橘種質資源圃。為減小試驗誤差，5個品種統一時間取材，取材時間為9：00-10：00 AM。

1.2柑橘氣孔器結構觀察

常規石蠟切片：將葉片剪成約5mm×5mm，于Carnoy’s固定液中固定24h－70％酒精漂洗－2％丙酸酒精媒染－愛氏蘇木精整染3-5d－自來水返藍24h－系列酒精脫水－5級二甲苯透明－石蠟包埋－5-8μm連續切片－中性樹脂封片－OlympusBX-41熒光顯微鏡鏡檢(530-550nm激發自發熒光)。

超薄切片制作：葉片剪成3mm×1mm.3％戊二醛-1.5％多聚甲醛4℃前固定3h.1％鋨酸-1.5％亞鐵氰化鉀后固定1.5h，pH7.2PBS漂洗；70％酒精飽和醋酸鈾染液4℃過夜，酒精一丙酮梯度脫水，環氧樹脂618包埋劑包埋；Leica EM UC6切片機進行超薄切片，切片厚度90nm，JEM-100CXⅡ透射電鏡觀察。

掃描電鏡樣制備參照李潤唐等的方法，處理后的樣品用JSM-6380LV掃描電鏡觀察。

1.3表皮細胞結構觀察與氣孔器分類

葉片剪成約0.5cm×0.5cm，迅速置于Carnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)中固定至完全褪綠，ddH₂O漂洗去除殘余固定液，3mol·L^-1NaOH溶液中(60℃水浴)處理2-3min(材料變成透明狀)，ddH₂O漂洗5遍。將處理材料置于載玻片上并滴加I₂-KI溶液染色30s，蓋玻片裝片后于Olympus BX-41顯微鏡鏡檢攝像。各品種隨機觀察氣孔約50個。圖像由Photoshop 7.0圖像處理軟件進行數值轉換，記錄氣孔器大小(即保衛細胞長度、寬度)、氣孔長度、寬度，副衛細胞數目等。數據用SPSS 16.0軟件進行統計分析。

2、結果與分析

2.1柑橘氣孔器結構

顯微結構觀察結果表明，參試5個柑橘品種的氣孔結構基本類似：其氣孔器向外突出；保衛細胞外表面外累積蠟質角質層并形成長橢圓形外開口，而保衛細胞內壁產生特異性加厚，形成一個狹縫形內開口；氣孔橫切面呈“漏斗”狀；副衛細胞下沉于保衛細胞下部；氣隙較狹小(圖版1-A-F)。可見、內開口影響氣孔的開張程度，是限制氣體、水分交換及病原微生物進入植物體內的關鍵因素。

2.2柑橘表皮細胞與氣孔器結構

柑橘葉片上表皮除中脈附近存在一帶狀分布的氣子L帶外，其他地方沒有氣孔。光鏡下可見副衛細胞壁明顯較表皮細胞壁薄(圖版2-d，f，h，i，l，n，p，r，t，v)。參試5個柑橘品種下表皮氣孔器均存在不同結構形態，其副衛細胞數目、保衛細胞大小及氣孔開度(內開口與外開口大小)均存在較大差異(圖版2-b-w)。柑橘葉片氣孔存在不同類型。

2.3柑橘氣孔器聚類分析

考慮到氣孔開度受環境因素變化的影響較大，而幼嫩葉片(1/2伸展)的氣孔器尚處于分化發育的早期階段，我們僅以氣孔器(保衛細胞)長度、寬度以及副衛細胞數目為變量對參試各品種完全伸展葉片的約50個氣孔進行Q型聚類分析(圖1)。5個品種的氣孔器均可以明顯地分為2種類型(即Ⅰ-型與Ⅱ-型)，其中Ⅰ-型氣孔器所占的比例均較小，而Ⅱ-型氣孔器的比例較大，但品種間2類氣孔器所占的比重略有不同。Ⅰ-型氣孔器保衛細胞較大，副衛細胞多為6-8個(圖版2-d，h，i，p，t)；Ⅱ-型氣孔器保衛細胞較前者小，副衛細胞多為4個(圖版2-f，j，n，r，v；表1)。

對2類氣孔器各項指標的統計分析結果表明，5個品種Ⅰ-型氣孔器與Ⅱ-型氣孔器在氣孔外開口長度與寬度、氣孔內開口長度與寬度、氣孔器大小以及副衛細胞的數目方面均存在顯著差異(表1)。表明氣孔的分類依據是可信的。

各品種間Ⅱ-型氣孔器的內開口寬度、氣孔器長度與寬度，以及副衛細胞數目存在差異，但變化不大：而Ⅰ-型氣孔器的各項形態指標均表現顯著差異，尤其是在氣孔內開口的差異最明顯(表1)。由此可以推測，Ⅰ-型氣孔器的內開口大小是影響各品種之間抗逆性差異的主要因素之一。

進一步的觀察還發現，樣本中2類氣孔器在分化時期與后期發育命運是不同的：Ⅰ-型氣孔器形成于葉片發育早期(圖版2-b，箭頭)而Ⅱ-型氣孔器主要形成于葉片伸展后期(圖版2-c，箭頭)；在葉片伸展發育晚期，卡拉卡拉紅肉臍橙、玫瑰橙與HB柚中的絕大多數Ⅰ-型氣孔器發生退化，春見Ⅰ-型氣孔器的退化率較低而稻葉溫州蜜柑的退化率最低。Ⅰ-型氣孔器退化的生物學意義尚不清楚，但可能與橙類葉片發育中的抗逆性增強有關。

3、討論

本試驗采用的簡易臨時裝片法通過固定液的褪綠作用及NaOH溶液的透明作用，能夠大大增加材料的透光性，可以避免因分離對表皮結構造成的破壞；而固定液的褪綠作用，以及藥物處理過程中的溫浴作用，可以進一步減少NaOH溶液的處理時間，保持表皮細胞及氣孔結構的完整性，同時也能夠克服堿液煮沸后導致的幼嫩葉片結構過度軟化而無法撕取的問題，獲得的表皮結構圖片效果極佳。與掃捕電鏡相比，該方法在氣孔內開口的測量精度上可能稍遜，但能獲得氣孔器除表面結構外的更多信息。如下沉副衛細胞的數目、細胞壁的結構特點等，且方法簡單，設備要求不高。

何天富所著《柑橘學》——書中明確指出，柑橘葉片上表皮沒有氣孔。這與本試驗的結果有所不同。參試5個柑橘品種葉片上表皮在主維管束附件均分布有一密集的氣孔帶。

在植物氣孔結構與發育的研究中，細胞的形狀、大小、垂周壁、表面結構，細胞質密度，細胞核大小，以及質體有無等均可用作區分別衛細胞與表皮細胞的形態學標準，副衛細胞的數目、位置、定向、生理及個體發育等常作為氣孔器分類的標準。氣孔器的分類研究表明，不同類型氣孔存在數目與結構不同的下沉副衛細胞。鞏乙南等依據副衛細胞的數目及保衛細胞的排列方式將瓦韋屬10種植物的氣孔器區分為6個基本類型。本試驗中，我們依據細胞壁的結構特點區分副衛細胞與表皮細胞，并首次根據氣孔周圍下沉副衛細胞的數目與氣孔器自身結構特點對3種柑橘植物5個品種葉片的氣孔器進行聚類分析，將柑橘氣孔器分為Ⅰ-型和Ⅱ-型2種類型。樣品涵蓋柑橘屬的3個大類，具有較好的代表性。2類氣孔器不僅在氣孔外開口長度與寬度、氣孔內開口長度與寬度、氣孔器大小等統計數據方面存在顯著差異，而且在氣孔器的分化時期與發育命運上也截然相同。表明副衛細胞數目作為柑橘類植物葉片的氣孔分類依據具有科學性，本研究的氣孔器聚類結果是可靠的。

如前言所述，柑橘潰瘍病病原細菌主要經氣孔或機械傷口進入植物組織而引起病變。對于細菌性病害，氣孔開度與作物的品種抗性有一定的相關性。李潤唐等研究發現，柑橘類植物葉片氣孔口存在內脊，并且內脊差異表現復雜。本試驗結果表明，參試柑橘屬5個品種氣孔保衛細胞內壁與外壁在細胞分化后期產生加厚，并在細胞外壁形成特化結構——蠟質層，氣孔橫切面呈現特異的“漏斗”狀，據此將氣孔結構劃分為內開口與外開口。在氣孔完全張開的情況下，柑橘葉片氣孔器內開口仍以縫隙存在，可見內開口大小最終決定氣孔的開張程度；氣孔內脊可能阻止病原菌進入植物組織，氣孔內開口寬度是影響病原細菌進入組織的關鍵因素。參試柑橘品種問Ⅱ-型氣孔器內開口寬度的差異不顯著，而Ⅰ-型氣孔器內開口寬度表現顯著差異，推測Ⅰ-型氣孔器的內開口大小與潰瘍病抗性密切相關。參試5個品種中，卡拉卡拉紅肉臍橙的Ⅰ-型氣孔器內開口寬度顯著大于其他品種，而同為橙類的玫瑰橙，其Ⅰ-型氣孔器外開口的寬度與卡托卡拉紅肉臍橙的相當，而內開口寬度卻顯著小于前者，由此可以推測，前者的感病性強；后者則有顯著的抗病性。這與各品種田間的抗病性調查基本吻合。

前人的研究表明，柑橘潰瘍病主要發生在葉片伸展達完全伸展葉片的約2/3時期，葉片發育完全后則極少或不發病。本試驗發現，臍橙與柚類葉片發育后期Ⅰ-型氣孔器可發生退化。Ⅰ-型氣孔器的退化，可改變葉片表面的微閥結構，可能與葉片發育后期抗性的提高存在緊密關系。有待專題深入研究。