炭疽病菌侵染對(duì)枇杷果實(shí)病程相關(guān)酶活性的影響

摘 要：對(duì)采后枇杷果實(shí)接種炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），研究測(cè)定一些與病程相關(guān)酶活性的變化。結(jié)果表明： 接種炭疽病菌的枇杷果實(shí)過(guò)氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性明顯升高，均于接種后第2天達(dá)到一個(gè)活性高峰，而POD于第5天出現(xiàn)了第二個(gè)活性峰，并且這兩種防御酶的峰值出現(xiàn)時(shí)間基本與明顯病斑顯癥時(shí)期一致；真菌細(xì)胞壁降解酶β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性都于第3天出現(xiàn)一個(gè)活性高峰，β-1，3-葡聚糖酶活性增幅高于幾丁質(zhì)酶。

關(guān)鍵詞：枇杷；炭疽菌；防御酶

中圖分類號(hào)：S436.611.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.05.001

Effect of Colletotrichum gloeosporioides Infection on Relevant Enzymes Changes of Loquat Fruit

TAO Jin-hua1， LIU Dai1， CHEN Fa-he2

（1.Xinjiang Agricultural Vocational Technical College， Changji，Xinjiang 830011，China; 2.College of Bio-Engineering， Jimei University， Xiamen，F(xiàn)ujian 361021，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ: The change of defense enzyme activity in the resistant reaction to Colletitrichum gloeosporiodes were studied after artificial inoculating postharvest loquats. The results showed that the activities of perroxidas(POD) and phenylalanine aminolyase (PAL) were significantly ascended， the maximum of them appeared on the second day after inoculating， and the second maximum of POD activity appeared on the 5th day.That was the activities of these enzymes markedly increased with increase of the time course of infection and the disease expansion. The activities of β-1，3-glucanase and chitinase in loquat fruits were both induced ，both of them appeared the maximum on the 3th day， and the activities of β-1，3-glucanase were increased in larger scope than those of chitinase.

Key words: loquat; Colletotrichum gloeosporioides; related defense enzyme

枇杷炭疽病是導(dǎo)致枇杷果實(shí)采后貯運(yùn)期間腐爛的最主要侵染性病害之一，主要發(fā)生在果實(shí)后熟期間，高溫多濕條件下尤其嚴(yán)重[1]。植物受到病原物侵染后，植物—病原物的互作或者植物對(duì)病原物入侵生理反應(yīng)的最基本原因是酶的催化作用[2]。目前已有研究報(bào)道，植物體內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化物酶(POD)與抵抗病原微生物侵染的能力密切相關(guān)，POD、PAL活性的提高能增強(qiáng)荔枝果實(shí)對(duì)霜疫病菌[3]、梨果實(shí)對(duì)輪紋病菌[4]、甜瓜對(duì)白粉病的抗性[5]。炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioide) 主要從氣孔或傷口侵入寄主， 從開始侵染到侵染成功， 寄主內(nèi)保護(hù)酶活性會(huì)發(fā)生變化[6]。本試驗(yàn)研究了采后枇杷果實(shí)經(jīng)人工接種炭疽菌后，病程相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，以明確枇杷果實(shí)采后對(duì)炭疽病產(chǎn)生的抗性機(jī)制中酶活性所起的作用。

1 材料和方法

1.1 供試品種

枇杷品種為“解放鐘”(Eriobowya japonica)，系黃肉品種，產(chǎn)地是福建省莆田市。

1.2 孢子懸浮液的制備

從枇杷病果上分離出的炭疽菌經(jīng)單孢分離純化后，接種在試管PDA斜面上，28 ℃下培養(yǎng)，待菌落布滿平板后用內(nèi)徑5 mm的打孔器打取炭疽菌菌塊，用無(wú)菌水配成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整其濃度達(dá)到1×105個(gè)·mL-1。

1.3 接種方法

選取大小一致、健康的枇杷，用自來(lái)水沖洗干凈后晾干，再經(jīng) 75%酒精表面消毒和紫外線照射5 min。采用針刺接種的方法，孢子懸浮液濃度為1×105個(gè)·mL-1，接種于健康果實(shí)的一側(cè)（另一側(cè)保持完整），以無(wú)菌水作為對(duì)照。取病斑組織和對(duì)照健康組織測(cè)定生物酶活性。

1.4 相關(guān)酶活性的測(cè)定方法

1.4.1 過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定 取接種后不同時(shí)間的枇杷組織，稱質(zhì)量，加入3倍體積0.2 mol·L-1醋酸緩沖液(pH=6.0，內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，15 mmol·L-1巰基乙醇)和少許石英砂，冰浴下研磨至勻漿，4 ℃，12 000×g離心 20 min，上清液即為粗酶液。酶活性測(cè)定參照朱廣廉等[7]的方法。測(cè)定OD470值，酶單位OD470·min-1·g-1。

1.4.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測(cè)定 分別取對(duì)照組與接種后不同時(shí)間的枇杷組織，稱質(zhì)量，用4倍體積的0.1 mol·L-1， pH8.8硼酸緩沖液(內(nèi)含15 mmol·L-1巰基乙醇，0.5%抗壞血酸和100 mg PVP)和少量石英砂，冰浴研磨至勻漿，4 ℃，12 000×g離心20 min，上清液即為粗酶液。PAL酶活性測(cè)定參照J(rèn)oston S A[8]和李靖[9]的方法。

1.4.3 幾丁質(zhì)酶（Chitinase）活性的測(cè)定 幾丁質(zhì)酶活測(cè)定參照Boller[10]法，測(cè)定OD585值，用N-乙酰葡萄糖胺作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以反應(yīng)時(shí)間零作參比，一個(gè)酶單位定義為1 h釋放出1 μg N-乙酰葡萄糖胺所需要的酶量。

1.4.4 β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase）活性的測(cè)定 參照杜良成[11]和Matthieu H等 [12]的方法，以昆布多糖還原釋放出的還原糖量測(cè)定該酶的活性。測(cè)OD540值，以反應(yīng)時(shí)間零作參比，一個(gè)酶單位定義為1 h內(nèi)還原昆布多糖產(chǎn)生1 μmol的還原糖所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化物酶（POD）活性的變化

試驗(yàn)結(jié)果如圖1，接種炭疽菌后，枇杷果實(shí)中的過(guò)氧化物酶（POD）活性明顯升高，在接種后第2天酶活性最高，而在接種后第5天出現(xiàn)了第二個(gè)活性峰，這可能是其參與并促進(jìn)了木質(zhì)素合成中最后的聚合反應(yīng)，以加強(qiáng)細(xì)胞壁木質(zhì)化程度。

2.2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的變化

試驗(yàn)結(jié)果如圖2，接種炭疽病菌后0～48 h內(nèi)，枇杷果實(shí)的PAL活性快速升高，到48 h時(shí)達(dá)到一個(gè)活性高峰，酶活性是接種前的1.59倍，之后活性迅速下降。而對(duì)照枇杷果實(shí)的PAL活性處在一個(gè)變化相對(duì)較小的狀態(tài)，至接種48 h前活性變化并不明顯。

2.3 幾丁質(zhì)酶（chitinase）活性的變化

試驗(yàn)結(jié)果如圖3，接種炭疽菌的病組織幾丁質(zhì)酶活性在0～36 h逐漸增大，在接種后36 h達(dá)到一個(gè)峰值，達(dá)到峰值時(shí)幾丁質(zhì)酶活性比對(duì)照果實(shí)的活性高出22.3％，然后逐漸降低，但始終高于對(duì)照。

2.4 β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase）活性的變化

接種炭疽菌后，枇杷組織中β-1，3-葡聚糖酶活性的變化見(jiàn)圖4。接種后36 h枇杷病斑組織中β-1，3-葡聚糖酶活性達(dá)到最高，且比對(duì)照組提高了62.65％。而對(duì)照組織中的β-1，3-葡聚糖酶活性沒(méi)有明顯變化。

3 結(jié)論與討論

本研究以采后枇杷果實(shí)為試材，研究其感染炭疽病菌后POD、PAL、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶活性的變化，結(jié)果表明這幾種酶活性變化量與感病程度呈正相關(guān)。這與墨蘭感染炭疽菌[13]、桃感染葡萄孢菌(Botrytis cinerea)[14]后相關(guān)酶活性變化特點(diǎn)基本一致。

POD、PAL、幾丁質(zhì)酶(chitinase)和β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-glucanase)是植物體內(nèi)重要的防護(hù)酶，在抵御病原菌侵入中發(fā)揮了重要作用。其中，POD是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧的清除劑，能氧化寄主或寄生物的重要代謝產(chǎn)物，如酚類物質(zhì)、酶及毒素、IAA等。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，與酚類物質(zhì)的聚集、木質(zhì)素和植保素等防御物質(zhì)的合成有密切關(guān)系[15]。曾有研究證實(shí)了POD與木質(zhì)素的積累呈正相關(guān)，接種后5 d過(guò)氧化物酶POD出現(xiàn)的第2個(gè)高峰主要與木質(zhì)素的合成有關(guān)[16]。陳喜文等[17]發(fā)現(xiàn)，黃瓜受白粉菌(Spaerotheca fuliginea)侵染后PAL在第60小時(shí)出現(xiàn)了高峰。

幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶活性的增加可能是由于果實(shí)后熟、衰老過(guò)程中，受病原菌誘導(dǎo)，而細(xì)胞壁降解產(chǎn)物往往具有誘導(dǎo)酶活性功能，兩種酶活性增加[18]。高鳴宇等[19]用疫霉毒素誘導(dǎo)新疆甜瓜后，幾丁質(zhì)酶和β-1，3 葡聚糖酶活性明顯增加。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，枇杷炭疽菌能誘導(dǎo)枇杷采后果實(shí)的β-1，3-葡聚糖酶活性變化時(shí)程與幾丁質(zhì)酶的變化時(shí)程相一致。至于果實(shí)出現(xiàn)明顯病癥時(shí)酶活性下降，可能是病原菌產(chǎn)生的代謝物對(duì)酶活性起抑制作用的結(jié)果[20]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 顏群，楊葉，黃圣明.枇杷果實(shí)病害及防腐保鮮[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2001，81（4）：16-18.

[2] Ahl-Goy P， Felix G，Métraux J P ， et a1．Resistance to disease in the hybrid Nicotiana glutinosa×Nicotiana debneyi is associated with high constitutive levels β-1，3-glucanase，chitinas，peroxidase and polyphenoloxidase[J].Physio Mo Plant Patho， 1992，41(7)：11-21．

[3]劉晉，劉愛(ài)媛，陳維信.霜疫病菌侵染對(duì)荔枝果實(shí)生理變化的影響[J].西南園藝，2006，34(1): 1-4.

[4]祝美云，趙曉芳，王貴禧.鴨梨果實(shí)接種輪紋病菌及生長(zhǎng)期、貯藏期防御酶系活性變化的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（3）:251-254.

[5]趙光偉，徐永陽(yáng)，徐志紅，等.甜瓜白粉病抗性反應(yīng)中相關(guān)防御酶活性變化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(16)：206-209.

[6]曾永三， 王振中. 豇豆銹菌誘導(dǎo)的2種酶活性與抗病性的關(guān)系[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 22(2): 117-122.

[7] 朱廣廉，鐘海文，張愛(ài)琴．植物生理學(xué)試驗(yàn)[M]．北京：北京大學(xué)出版社，1985：37-39.

[8] Joston S， Robert. Effect of high carbon dioxide concentration on PAL activity and phenolic contents in ripening cherimoya fruit[J].Postharvest Biology and Technology，2001，23:33-39.

[9] 李靖，利容千．黃瓜感染霜霉病菌葉片中一些酶活性的變化[J]．植物病理學(xué)報(bào)，1991，21(4)：277－283.

[10] Boller T.Localization of ethylene induced chitinase in bean leaves[J]. Plant Physiol，1984，74:442-444.

[11] 杜成良，王鈞. 稻瘟菌誘導(dǎo)的水稻幾丁酶和β-1，3-葡聚糖酶活性及分布[J].植物生理學(xué)報(bào)，1992（18）：29-36.

[12] Matthieu H J， Pierre D W. Identification of several pathogenesis related proteins in tomato leaves inoculated with Cladosporium fulvum (syn. Fulvia fulva) as β-1，3 -Glucanases and chitinases[J].Plant Physiol，1989，89(3):945-951.

[13] 王利國(guó)，李玲，郭穗棉.炭疽病對(duì)墨蘭葉片3種保護(hù)酶活性的影響[J].園藝報(bào)，2004，31(6)：822－824.

[14] Ghaouth A E，Wilson C L，Callahan A M. Induction of chitinase，beta-1，3-glucanase，and phenylalanine ammonialyase in peach fruit by UV-C treatment[J].Phytopathology，2003，93：349-355.

[15] 宋風(fēng)鳴，鄭重，葛秀春，等．活性氧及膜脂過(guò)氧化在植物-病原菌互作中的作用[J]．植物生理學(xué)通訊，1996，32(5) ：377-385.

[16] 郭紅蓮，白雪芳，李曙光，等.殼寡糖誘導(dǎo)草毒細(xì)胞活性氧代謝的變化[J].園藝學(xué)報(bào)，2003，30 (5)：577-579.

[17] 陳喜文，郝友進(jìn)，陳德富，等.含氮雜環(huán)化合物對(duì)黃瓜白粉病抗性的誘導(dǎo)作用及其與防御酶系統(tǒng)的關(guān)系[J].植物病理學(xué)報(bào)，2003，33 (6)：535-540.

[18] Darvill A G， Albersheim P.Phytoalexions and their elicitors-a defence against microbial infection in plants[J]. Ann Rev Plant Physiol，1984，35:243－275.

[19] 高鳴宇，蔣萍，李冠．新疆甜瓜經(jīng)疫霉毒素誘導(dǎo)后酶活性的變化[J]．植物生理學(xué)通訊，1998，34（4）：256-258.

[20] 蔣躍明， 馬國(guó)華， 陳芳. 芒果采后潛伏真菌活化與幾丁酶、β-1，3-葡聚糖酶的研究[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 1995， 22(1): 80-84.

收稿日期：2011-05-30；修訂日期：2011-08-04

作者簡(jiǎn)介：陶金華（1979-），女，江蘇人，講師，碩士，主要從事果蔬采后保鮮與加工技術(shù)的教學(xué)與科研工作。