黃傘菌株拮抗試驗與酯酶同工酶分析

摘 要：采用酯酶同工酶技術和拮抗試驗對11個黃傘菌株進行遺傳多樣性分析，結果表明：酯酶同工酶可將菌株在相似系數0.76水平上劃分為3個類群，同工酶分析結果與拮抗反應結論基本一致，證明兩種分析方法可作為黃傘分類鑒定的依據。

關鍵詞：黃傘；拮抗反應；酯酶同工酶；聚類分析

中圖分類號：S646 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.05.004

Antagonistic Test and Esterase Isoenzyme Analysis of Pholiota Adiposa Strains

ZI Hui-jun，LIU Lian-qiang， ZHOU Yong-bin， ZHANG Zhi-jun，WEI Xue-sheng

（Tianjin Research Institute of Forestry and Pomology，Tianjin 300384，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ: The antagonistic test and esterase isoenzyme analysis were used to study Pholiota adipose strains. The results showed that the strains were classified into 3 groups with GS 0.76. Comparing with the results， we found that the cluster analysis and antagonistic test were in accordance with each other. The study indicated that antagonistic effect and esterase isoenzyme analysis were effective in identification of Pholiota adipose strains.

Key words: Pholiota adiposa；antagonistic test；esterase isoenzyme；cluster analysis

黃傘（Pholiota adiposa（Fr.）Quél.），又名多脂鱗傘或肥鱗傘[1]，俗稱刺兒蘑、柳蘑等。黃傘子實體菌肉肥厚、營養豐富，而且還含有氨基酸、多糖、麥角固醇等多種生物活性物質，是一種藥膳同功的珍稀食用菌[2-3]。野生黃傘在中國分布廣泛，尤以北方地區常見，每年春季和秋季生長于楊、柳及樺等倒木或枯枝上[4]。目前國內對黃傘的研究主要停留在野生馴化、生物學特性及人工栽培技術等方面，對黃傘的分類鑒定研究未見報道。本研究利用拮抗試驗和酯酶同工酶技術對黃傘菌株進行分析，為菌種鑒別和遺傳育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

Pa-1、2、3、4為采集天津野生黃傘組織分離獲得的菌株，Pa-5、6、7購于福建三明市真菌研究所，Pa-8購于江蘇江都天達公司，Pa-9購于湖北華中農業大學，Pa-10為來源于河南的滑菇，Pa-11購于北京吉蕈公司，Pa-12來源于湖南。編號順序為1～12。

1.2 供試培養基及試劑

PDA固體培養基；PDM液體培養基；分離膠緩沖液(pH值8.9)；濃縮膠緩沖液(pH6.7)；10%過硫酸氨(AP)；分離膠母液；濃縮膠母液；電極緩沖液Tris-Gly（pH值8.3）；0.1%溴酚藍水溶液；pH值7.4磷酸緩沖液；酯酶染色液[5]。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲活化 將供試菌種分別接種于無菌的PDA斜面培養基上，25 ℃恒溫培養14 d。

1.3.2 拮抗試驗 無菌操作環境下，將供試菌株接入PDA平板培養基，每平板接入2個菌株，菌種塊間距2～3 cm，于25 ℃培養10～15 d，待兩個菌落邊緣接近后，觀察菌絲接觸區有無隆起拮抗線條紋或縫隙等對峙反應，若無則表示兩個受檢菌株極相似或相同。

1.3.3 菌絲體液體培養 將活化后的供試菌株分別接種于含有100 mL無菌PDM液體培養基的250 mL三角瓶內，25 ℃恒溫、150 r·min-1搖床培養15 d。

1.3.4 酶液制備 將培養所得菌絲球用尼龍網過濾，無菌水沖洗2～3次，濾紙吸干水分，-20 ℃低溫冰箱冷凍24 h后，置于滅菌研缽中，再加入與菌絲等質量的pH值7.4的樣品提取液，冰浴上充分研磨成糊狀。在4 ℃，10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清。將上清液、40%蔗糖溶液、0.1%溴酚藍溶液按5∶1∶1比例混勻即為電泳樣品，于4 ℃冰箱內保存備用。

1.3.5 制膠與點樣 采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7%（pH值8.9）；濃縮膠濃度4%（pH值6.7）；電極緩沖液為Tris-Gly系統（pH值8.3）；點樣量50μL。

1.3.6 電泳及染色 開始電泳采用15 mA的電流，待溴酚藍進入分離膠后，將電泳槽放入冰浴中低溫電泳，加大電流至30 mA，當溴酚藍距膠板底部1 cm時，停止電泳。將凝膠轉入染色液中，37 ℃下染色30 min，待顯出清晰酶帶后，用蒸餾水漂洗數次，7%醋酸固定脫色后拍照[5]。

1.3.7 數據處理 測量酶譜帶遷移距離，計算Rf值(Rf=酶帶遷移距離/溴酚藍遷移距離)并繪酶譜圖。將凝膠上的染色酶帶分為：0=沒有；1=有。統計各個菌株的酯酶同工酶信息，輸入聚類分析軟件NTsys 2.10e進行分析，建立各菌株酯酶同工酶的聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 菌株拮抗試驗結果

在遺傳背景不同的真菌交界區會形成明顯的分界線，這便是拮抗反應[6]。菌絲間形成拮抗現象，是菌種間不親和性的遺傳表現[7]。從表1可以看出，有拮抗現象的菌株共有64對，其中62對拮抗非常明顯；Pa-3和Pa-6、Pa-5和Pa-7菌株間拮抗不明顯，可能親緣關系較近；2對菌株無拮抗現象，分別是Pa-6和Pa-7、Pa-11和Pa-12，表明菌株間親緣關系極近。滑菇與其他11個黃傘菌株間均有強烈的拮抗反應，說明滑菇和黃傘雖同為鱗傘屬，但親緣關系較遠。

2.2 供試菌株酯酶同工酶表型分析

2.2.1 12個菌株酯酶條帶的差異

圖1為根據酶帶Rf值繪出的酯酶同工酶電泳酶譜簡化圖。如圖所示，12個菌株共檢測出遷移率不同的22條譜帶，Rf值介于0.1～0.81，絕大多數菌株間酶譜帶數目和遷移率不同，各菌株的酶帶數目由7～12條不等。據此，供試的12個菌株分為11個酶譜類型，絕大部分菌株酶帶存在遺傳差異。

Est5(Rf=0.29)、Est16(Rf=0.64)、Est21(Rf=0.78)在供試的12個菌株中均表現(圖1)。菌株Pa-10為滑菇，在分類上與黃傘同屬鱗傘屬，因此，Est5、16、21可作為鱗傘屬菌株的基礎酶譜帶。滑菇（Pa-10）除了3條基礎譜帶外，酶譜類型與其他11個菌株差異較大。

2.2.2 黃傘菌株酶譜特征 酶帶Est18(Rf=0.69)在供試的11個黃傘菌株中均表現，Est12(Rf=0.54)在除Pa-3的10個黃傘菌株中表現，而滑菇（Pa-10）酶譜中則未出現，Est12、18可作為黃傘菌株特有的基礎酶帶。野生黃傘酶譜除了基礎酶帶，Est6(Rf=0.34)只在4個天津野生菌株中表現，其他菌株未出現。Pa-6、Pa-7的酶譜帶完全相同。

2.3 基于酯酶同工酶聚類分析

由相似系數聚類樹狀圖可知(圖2)，12個菌株兩兩間相似系數（GS）的分布范圍為0.54～1。相似系數越大，親緣關系越近。在相似系數0.54水平上，可將12個菌株劃分為兩大類群，第Ⅰ大類群包括11個黃傘菌株；滑菇菌株獨立為第Ⅱ大類群。在0.76水平上第Ⅰ大類群可劃分為3個類群：4個天津野生菌株聚為一個類群；第二群為購于福建的菌株；第三類群包括從江蘇、湖北、北京、湖南等地引入的菌株。

2.4 親緣關系分析

滑菇（Pa-10）與黃傘同屬不同種，因此與11個黃傘菌株親緣關系較遠。4個野生株之間的相似系數較其他的黃傘菌株高，反映出親緣關系可能與地理來源相關。Pa-6與Pa-7相似系數為1，表明在遺傳上沒有變化，估計為同種異名。Pa-11和Pa-12間的相似系數高達0.96(圖2)，親緣關系接近。

3 討 論

（1）拮抗試驗是鑒定食用菌遺傳差異的傳統方法，菌絲間的拮抗反應是體細胞不親和性的具體體現。但這一方法也表現出很大的局限性，往往不能有效地區分出在遺傳上有相似背景或親緣關系的菌株[7]。同工酶分析技術，可以從蛋白質水平反映出物種的遺傳變異，分辨率高 [8]，目前已廣泛應用于食用菌菌株的鑒別中[9]。其中，酯酶同工酶是最穩定、易檢測的酶系統，成為食用菌鑒定常采用的方法之一[10]。

（2） Pa-6和Pa-7、Pa-11和Pa-12菌株間無拮抗反應，表明菌株的遺傳差異極小。酯酶同工酶結果進一步確定Pa-6和Pa-7具有共同的遺傳基礎，可能為同種異名，而Pa-11和Pa-12間雖無明顯拮抗現象，但是同工酶分析出二者相似系數為0.96，還存在一定的遺傳差異。Pa-6和Pa-7之間拮抗反應弱，聚類結果（圖2）顯示兩個菌株屬同一類群，親緣關系較近。

（3）采用酯酶同工酶分析與拮抗試驗相結合的方法，能夠比較全面地鑒別和分析黃傘菌株，也表明了拮抗試驗在黃傘親緣關系的初步鑒定中是有效的，酯酶同工酶能夠準確地反映種或菌株水平上的遺傳差異，可作為黃傘種質資源分類鑒定的有效生化標記。

參考文獻：

[1] 劉波.山西大型食用真菌[M].太原:山西高校聯合出版社，1991：59-60.

[2] 應建浙，趙繼鼎，卯曉嵐，等.食用蘑菇[M].北京:科學出版社，1984：1-255.

[3] 黃清榮，辛曉林，姜華，等.碳、氮濃度對黃傘深層培養的影響[J].河南農業科學，2006（2）:90-92.

[4] 馬鳳，張天民，昌明，等.黑龍江省珍稀野生黃傘馴化栽培技術的研究[J].中國林副特產，2006（5）：34-37.

[5] 中華人民共和國農業部. NY/T 1097-2006食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[6] 王磊，蔡德華，宿紅艷，等.拮抗實驗和RADP對雞腿菇栽培菌株親緣關系的研究[J].安徽農業科學，2006，34(16):3903-3904.

[7] 譚琦，潘迎捷，陳明杰，等.以交配型基因為主要標記的香菇菌種鑒定新方法[J].食用菌學報，1998，5（3）:6-11.

[8] 張樹庭，林芳燦. 蕈菌遺傳與育種[M].北京:中國農業出版社，1997:190.

[9] 李中振，田廷亮.靈芝超氧化物歧化酶同工酶的研究[J].中國食用菌，1997(4):32-34.

[10] 王賢樵，王澤生.雙孢蘑菇同工酶標記篩選研究[J].中國食用菌，1989(6):7-11.

收稿日期：2011-05-23；修訂日期：2011-07-29

作者簡介：訾惠君（1971-），女，天津人，助理研究員，碩士，主要從事食用菌育種及栽培研究。