響應面法優化紫紅紅球菌的發酵培養基

摘 要：采用響應面法優化腈水合酶產生紫紅紅球菌的發酵培養基。以天冬酰胺、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、酵母抽提物、脲素、氯化鈷為影響因子，以菌體干質量和酶活為響應值，進行多元二次響應回歸分析，結果顯示，最優培養基為：天冬酰胺含量0.04%、磷酸氫二鉀0.05%、磷酸二氫鉀0.03%、酵母抽提物（FM818）5.48%、脲素0.55%、氯化鈷0.01%；在搖瓶中進行驗證試驗，優化條件下菌體干質量為33.98 mg·mL-1、酶活為167.57 U·mL-1；對照條件下菌體干質量26.6 mg·mL-1、酶活為125.63 U·mL-1，此優化培養基使干質量、酶活分別提高了27.74%和33.38%。

關鍵詞：響應面分析；紫紅紅球菌；腈水合酶；丙烯酰胺

中圖分類號：TQ225.1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.05.005

Optimization of the Fermentation Medium of Rhodococcus rhodochrous Using Response Surface Methodology

LI Xiao1，2，3， ZHANG Ya2 ， LI Jian-hua2， YAO Juan1， LI Pei1， LIANG Yun-xiang3， LI Zhi-hong1， YU Xue-feng1

(1.Angel Yeast Company Limited，Yichang，Hubei 443003，China; 2.College of Chemistry and Biology， Three Gorges Univerity，Yichang，Hubei 443002，China; 3.College of Life Science， Huazhong Agricultural University，Wuhan， Hubei 430068，China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ: This research， response surface methodology(RSM) was utilized to optimize the fermentation medium of Rhodococcus rhodochrous which can produce nitrile hydratase. Asparagines，dipotassium hydrogen phosphate， potassium dihydrogen phosphate， yeast extract， urea， and cobalt chloride were selected as influencing factors . Dry cell weight(DCW) and enzyme activity was used as the response values and RSM was applied to analysis the results. The optimum fermentation medium obtained by RSM analysis were as follows，0.04% asparagine， 0.05% dipotassium hydrogen phosphate， 0.03% potassium dihydrogen phosphate， 5.48% yeast extract， 0.55% urea and 0.01% cobalt chloride. Finally， Verification test was accomplished in shaking flasks， DCW and enzyme activity were 33.98 mg·mL-1 and 167.57 U·mL-1 respectively， compared to that of the control (DCW and enzyme activity were 26.6 mg·mL-1 and 125.63 U·mL-1 respectively)， DCW and enzyme activity were increased by 27.74% and 33.38%， respectively.

Key words: response surface methodology; Rhodococcus rhodochrous; nitrile hydratase; acrylamide

丙烯酰胺(簡稱AM，結構式為CH=CH—CONH2)是一種用途廣泛的重要有機化工原料，可用于合成聚丙烯酰胺，市場需求很大[1-2]。以前常用化學合成法合成丙烯酰胺，現在，用生物合成法合成丙烯酰胺已成為熱門研究課題之一[3-4]。生物合成原理主要是利用腈水合酶在溫和條件下將丙烯腈轉化成丙烯酰胺，目前已知能產生腈水合酶的微生物有：紅球菌 (Rhodococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、假諾卡氏菌(Pseudonocardia)、節桿菌(Arthrobacter)、芽孢桿菌(Bacillus)、諾卡氏菌 (Nocardia)等[5]。所有腈水合酶均為胞內酶，微生物體內產腈水合酶量的大小取決于培養環境條件、培養基營養成分及酶表達所需誘導劑等[6]。

響應面法（RSM）是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法[7-9]。本研究采用響應面法優化腈水合酶產生菌紫紅紅球菌的培養基，得到了較好的結果。

1 材料和方法

1.1 菌 種

紫紅紅球菌Rhodococcus rhodochrous CGMCC 4.1147T。

1.2 培養基

種子培養基：葡萄糖 1%，天冬酰胺 0.05%，K2HPO4 0.05%，安琪酵母浸出物FM818 0.2%，牛肉膏0.2% MgSO4·7H2O 0.05%，pH值7.2。

發酵培養基：葡萄糖2.31%，天冬酰胺0.05%，K2HPO4 0.05%，KH2PO4 0.05%，安琪酵母浸出物FM818 2%，牛肉膏0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，脲素0.1%，氯化鈷0.1%，pH值7.2%。

單因子培養基：在其他成分不變的情況下改變單個因子的濃度；響應面培養基：葡萄糖 2.31%， 牛肉膏 0.2%，其他組分按表1、表2添加。

1.3 菌體培養

種子培養：將斜面種子接種于搖瓶種子培養基中，搖床轉速為150 r·min-1，在28 ℃條件下培養24 h。

發酵培養：將種子以10％的接種量接種至搖瓶發酵培養基中，于 150 r·min-1，28 ℃振蕩培養72 h。

1.4 測定方法

干質量（dry cell weight，DCW）的測定[10]：菌體濃度定義為單位體積菌液中所含菌體經烘干至恒質量時的質量，單位為g·L-1。計算公式：菌體濃度Cx（mg·mL-1）=菌體細胞干質量/發酵液體積

酶活的測定溴化法[11-12]：腈水合酶活力的定義：28 ℃時每分鐘生成1μmol丙烯酰胺為1U。

相對酶活的定義：每mL發酵液中所具有的腈水合酶的酶活，單位為U·mL-1發酵液。

還原糖含量的測定DNS方法[10]。

NH4+的測定苯酚-次氯酸鹽法[10]。

氨基氮的測定甲醛氧化法[10]。

2 結果與討論

2.1 單因素影響試驗

研究發現，天冬酰胺、酵母浸出物（YE）、Co2+、脲素均對菌體生長及腈水合酶有一定影響。當天冬酰胺濃度達到0.05%時，菌體的菌濃（DCW）和酶活均達到最大值，當其濃度進一步增加時，DCW和酶活下降。隨著YE濃度的增加，DCW和酶活均增加，考慮到YE的溶解度，選擇5%含量作為下一步培養基優化條件。當氯化鈷濃度達到0.05%時，酶活達到最大，當其濃度進一步增加時，酶活下降，但菌體的DCW基本沒變化，這可能是腈水合酶是金屬酶，在酶的活性中心含有螯合的金屬離子，Co2+作為輔助因子，Co2+只參與酶的折疊，故對DCW的貢獻不大，但Co2+濃度過低，沒有完全發揮對酶的誘導作用，酶活較低，Co2+濃度過高會對菌體產酶有抑制作用。選擇氯化鈷含量為0.05%作為下一步的培養基優化條件。當脲素濃度達到0.07%時，DCW和酶活達到最大，當脲素濃度再增加時，酶活下降，選擇脲素含量為0.07%作為下一步的培養基優化條件。

2.2 響應面設計試驗

2.2.1 響應面設計方案及結果 在單因子的基礎上，用中心組合設計進行六因素三水平的試驗設計，選擇對紫紅紅球菌影響較大的幾個因素：天冬酰胺、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、酵母抽提物、脲素、氯化鈷，分別以A、B、C、D、E、F代表，每個自變量按低、中、高3個水平分別進行編碼，以干質量和酶活為響應值。設計的因素及其水平如表1所示。

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗 從表2各組試驗干質量和酶活的數據中可大致看出，當菌體干質量較大時酶活也較高，表明菌濃與酶活有一定的相關性。

分別以DCW及酶活為響應值，應用Design Expext 軟件，對表2的干質量、酶活結果進行分析，結果如表3、表4所示，數據經過二次回歸擬合后，可得干質量的回歸方程（1），酶活的回歸方程（2）。

Y1=14.02+0.44A-0.69B+0.26C+13.40D+1.69E-9.38F+0.25AB-0.19AC+0.11AD-0.13AE-0.48AF-0.042BC-0.85BD+0.41BE+0.23BF+0.15CD+0.60CE-0.25CF+0.82DE-2.73DF-0.63EF-1.15A2-0.032B2-3.30C2+6.05D2-0.70E2+5.82 F2 （1）

Y2=68.42+2.05A-3.18B+1.61C+64.05D+10.15E-48.30F+1.38AB-1.25AC+0.74AD-0.42AE-3.22AF-1.36BC-3.22BD+2.20BE+0.57BF+1.27CD+4.71CE-0.41CF+3.76DE-7.05DF-3.45EF-4.22A2+1.90B2-24.41C2+30.21D2-2.23 E2+34.79F2 (2 )

由表3、表4可知：干質量模型、酶活模型回歸顯著（模型回歸P＜0.000 1），失擬不顯著；該干質量模型的回歸系數R2=0.968 3，Raj2=0.932 6，酶活模型的回歸系數R2=0.945 7，Raj2=0.884 9，表明模型擬合度很好，預測值和實測值的相關性好，可以用來預測紫紅紅球菌發酵時的生長產酶情況。

在干質量模型中D（酵母抽提物），E（脲素），F（氯化鈷）， DF， C2， D2， F2 的P值均小于0.01，表明酵母抽提物、脲素、氯化鈷對紫紅紅球菌的生長是高度顯著的，而且酵母抽提物、氯化鈷對紫紅紅球菌干質量的貢獻不是簡單性的變多。而在D（酵母抽提物）， E（脲素）， F（氯化鈷）， DF， C2， F2 的P值均小于0.05，證明脲素、氯化鈷的作用是顯著的；其中D的P值小于0.000 1，表明酵母抽提物對酶活的影響是高度顯著的，而且酵母抽提物、氯化鈷對紫紅紅球菌干質量的影響也是明顯的；進一步吻合了對表2各組試驗干質量和酶活的數據的分析，菌體濃度和酶活成一定的正相關性，因此，在紫紅紅球菌的發酵過程中，提高菌體濃度尤為重要。

2.2.3 響應面分析圖 響應面的三維（3D）立體圖如圖1所示，響應面最高點表示DCW或酶活的最大預測值，由Asn與KH2PO4及Asn與尿素的交互作用可看出，Asn、KH2PO4和尿素趨近于某一濃度時，DCW或酶活有最大預測值，即DCW或酶活的模型方程有最優解。說明該模型設計合理。

2.2.4 驗證性試驗 根據求得的最優回歸方程和試驗結果，得到最優的培養基組合：天冬酰胺含量0.04%、磷酸氫二鉀0.05%、磷酸二氫鉀0.03%、酵母抽提物5.48%、脲素0.55%、氯化鈷0.01%，菌體干質量DCW可達34.014 1 mg·mL-1，酶活可達168.768 U·mL-1。為了驗證優化的可靠性，在搖瓶中進行了對照組、優化組的驗證試驗，結果如表5所示。

3 結 論

本研究通過單因子試驗確定了紫紅紅球菌發酵的主要影響因子及最佳濃度，進一步通過響應面設計、Design Expext軟件分析，得到優化培養基，其組分為：天冬酰胺0.04%、磷酸氫二鉀0.05%、磷酸二氫鉀0.03%、酵母抽提物5.48%、脲素0.55%、氯化鈷0.01%，通過對二次回歸方程求最大值預測菌體干質量可達34.014 1 mg·mL-1，酶活可達168.768 U·mL-1。

在搖瓶中進行驗證試驗，得到優化條件下菌體干質量為33.98 mg·mL-1、酶活為167.57 U·mL-1，與軟件預測基本吻合；較優化前的培養基，干質量、酶活分別提高了27.74%和33.38%，對紫紅紅球菌的培養及腈水合酶的生產有一定的指導作用。

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收稿日期：2011-06-24;修訂日期：2011-08-10

作者簡介：李嘯(1969-)，男，湖北人，副教授，博士，主要從事微生物反應過程的優化與控制方面的研究。