磨劍20年 探尋觸液核

在各腦室壁上均見有觸液結構分布，但以第三腦室壁分布最為密集。它們的胞體位于腦室壁，與腦脊液相接觸，通過長長的突起，或將信息傳向腦實質。

兔年伊始，徐州醫學院傳來喜訊：苦心鉆研20年，由該院麻醉學國家重點學科建設點首席帶頭人張勵才教授負責的“腦脊液—腦—脊髓途徑痛與鎮痛的形態學基礎與分子機制”研究獲得江蘇省2010年度科技進步一等獎，這是徐州醫學院建校以來在科技成果獎項上的歷史性突破。

困難：缺乏特異標記物

長期以來，腦通過外周神經來支配相應器官一直被公認為機體調節的經典通路，而這一傳統觀念也主導著人們對正常生命調控機制的認識和疾病診斷治療的思路。在臨床上，通過腦脊液移植細胞或注射藥物會對機體產生影響，治療某些疾病，當機體出現問題時，腦脊液中的物質會發生改變。但在正常情況下，腦和腦脊液之間存在著腦脊液—腦屏障（cerebrospinal fluid-brain barrier），將其彼此隔開。這種屏障的光鏡結構基礎包括了室管膜細胞層—基膜—室管膜下細胞層；從超微結構顯示看，屏障相鄰細胞間存在著緊密連接、縫隙連接、橋粒等多種連接形式，一般大于4000道爾頓的物質難以自由通過腦脊液—腦屏障。

張勵才認為：在腦組織中很可能存在著一種可以穿越腦脊液—腦屏障的特殊神經結構，能夠在腦—腦脊液之間進行物質運轉、信息傳遞或功能調控。“如果能夠找到這種特殊的神經結構，不僅能對腦解剖學作出新貢獻，也會對正常生命調控機制的認識和疾病診斷治療的思路產生重大影響，這對生命科學和醫學都具有及其深遠的重要意義。”張勵才說。

百余年來，不斷有人嘗試尋找腦—腦脊液之間的聯系結構。1871年，Landolt利用銀染技術首次觀察到兩棲動物視網膜中，有一些雙極神經元的突起能越過視網膜形成膨大，伸入視網膜和色素上皮細胞層之間的空隙中，由于該腔隙內充滿腦脊液，故有人將該神經元首次描述為“接觸腦脊液神經元”(cerebrospinal fluid contacting-neuron，CSF-CN），簡稱觸液神經元。

1978年又有學者發現，在腦室系統特定部位有個別神經元，胞體全部浸于腦脊液中，但突起的去向卻無法觀察。近40年來，陸續有學者在側腦室、第三腦室、第四腦室、脊髓中央管壁上發現神經纖維（突起）伸到腦脊液中，但都無法觀測它們的胞體在哪里。由于這種特殊類型的神經元在不同的種屬動物中都得到證實，匈牙利學者將其稱為接觸腦脊液神經元系統(cerebrospinal fluid contacting-neuron system)，即觸液系統。

觸液系統的描述主要基于一般染色切片條件下，所見到的神經元或神經纖維貼近腦室或位于腦脊液中而得到的結果。要真正發現腦實質內神經元與腦脊液的聯系，清晰顯示這種特殊神經元的胞體與纖維（突起）十分困難。因為腦組織就像一團“豆腐”，即使存在這種結構，沒有特異性的標記物，也無法識別它。

張勵才認為，理想的特異性標記物應具備這樣的標準：只標記接觸腦脊液神經結構，而不標記其他結構。國內外眾多學者為尋找這種理想的標記物作出了不懈努力，有學者曾將放射性自顯影物質等引入腦室系統，試圖標記接觸腦脊液的神經結構，但未能獲得滿意結果。這是由于所用的標記物分子顆粒太小，大多可自由滲入到腦組織中，腦實質內的非觸液神經元也可被標記，因此其結果難以使人信服。多年來，尋找識別觸液神經元特異性標記物的研究一直未能取得突破性進展。

解決：找到理想標記物

從20世紀80年代末開始，張勵才就致力于尋找理想標記物的研究。霍亂毒素亞單位B與辣根過氧化物酶復合物（CB-HRP）是一種常規的外周神經示蹤劑，因其對中樞神經元標記效果差，一般不用于腦內神經元的標記，但能否用來標記這種特殊的神經元卻未見先例。

1992年，張勵才等首次將該物質引入側腦室，結果發現該物質自側腦室依次進入第三腦室、第四腦室、脊髓中央管直至腦和脊髓的軟膜面，形成清晰的輪廓。這說明CB-HRP不能通過腦脊液—腦屏障，只能在腦室系統內運行。在全腦和脊髓的大量切片中，張勵才等發現存在著被CB-HRP清晰標記的神經元及神經纖維。由于CB-HRP不能自由擴散到腦組織中去，因此，在腦實質內見到的被標記的神經元或神經纖維只能是與腦脊液接觸的神經結構，而不與腦脊液接觸的神經結構則不會被標記。張勵才說：“由此可以確認CB-HRP就是理想的觸液神經元示蹤劑。”

這一科學、可靠的標記法的發現，為進一步證實腦和腦脊液之間存在著物質運轉、信息傳遞或功能調控的特殊神經結構奠定了最為關鍵的方法學基礎。藉此方法，張勵才等不僅證實了各腦室壁存在著胞體位于腦室壁，突起伸向腦實質的觸液結構，也發現了在腦和腦脊液之間雙向傳遞信息的特殊神經結構。

突破：首次發現觸液核

利用同樣的方法，張勵才在國際上首次發現腦實質內存在與腦脊液相接觸的特殊神經核群，它們恒定位于腦的特定部位，并高度集中地匯集在一起。通過連續切片觀察發現，它們占據一定的空間體積，形成一個境界分明的神經核團。

“由于這些神經核群的胞體位于腦實質內，而突起卻伸在腦室系統的腦脊液中，根據神經核團的定義規則，我們將其命名為接觸腦脊液神經核，簡稱觸液核。”張勵才說。觸液核的發現，第一次為腦實質內存在著聯系腦和腦脊液的特殊神經結構提供了明確的形態學證據。

接著，張勵才利用計算機三維重建的方法，首次確認了觸液核在腦內的位置關系、空間大小與立體定位坐標，為研究核團的功能提供了精確定位的方法學基礎。與此同時，他又進一步觀察、比較了觸液神經元與普通神經元超微結構特點及信息傳遞的方向，為觸液核能夠在腦和腦脊液之間執行物質轉運、信息傳遞或功能調控提供了有力的形態學證據。

張勵才沒有止步于前期的研究成果，為了探尋腦和腦脊液之間信息傳遞的突觸基礎，他將研究目標進一步定位于此。“我們用CB-HRP電鏡技術觀察了觸液神經元與腦內非觸液神經結構之間的突觸關系，結果發現它們之間存在著多種形式的突觸關系。”張勵才介紹，“通過觀察這些突觸結構的方向，我們證明了這些突觸結構既能將腦內的信息傳給腦脊液，也能將腦脊液的信息傳給腦實質，它們在腦和腦脊液之間起到雙向信息傳遞的橋梁作用。”這些突觸結構的發現提供了觸液神經元能在腦和腦脊液之間傳遞信息的突觸基礎。

與此同時，張勵才等在光鏡下觀察到，觸液神經元的有些纖維似乎與腦內血管相連，有的甚至伸入管腔，他們大膽猜想，觸液神經元很可能與腦血管之間存在某種關系。為了證實這個猜想，他們又進一步通過電鏡對這些纖維進行觀察，這次則清楚地看到了觸液神經元特異性標記物不僅存在于毛細血管壁的內皮細胞，也存在于毛細血管腔。這個發現為觸液神經元與腦血管之間的直接聯系提供了形態學證據，同時也提示了觸液神經元很可能參與腦血管的調節和信息傳遞。

深入：探討觸液核與生命活動

為了探尋觸液神經元與特定生命活動之間的關系，張勵才等運用免疫熒光與激光共聚焦顯微鏡技術相結合的方法，從核團的物質分布著手，進一步探索了這個神經核團在生命活動中的功能作用。

張勵才介紹，經過不斷研究，目前已確認了10余種神經活性物質（包括遞質、受體、離子通道等）在觸液核神經元的表達變化；同時，研究小組還制作了經典的神經病理性疼痛、噪聲應激、嗎啡依賴與戒斷等動物模型，觀察了在疼痛、應激、嗎啡依賴與戒斷等生命活動發生時，核團與腦脊液物質變化的規律，利用這些方法初步揭示了觸液核團在不同生命中的調控作用。

據了解，霍亂霉素亞單位B與皂草素復合物（CB-SAP）是國際上新近耦合成功、專用于外周神經的一種毀損劑，特性與CB-HRP一樣，該試劑能否用來毀損觸液神經元不得而知。

張勵才等將CB-SAP引入腦室系統，并采用國際上新近開發的Fluoro-Jade C變性神經元染色法與激光共聚焦顯微鏡技術相結合的方法觀測潰變效果，結果顯示，CB-SAP不僅能可靠標記觸液神經元，而且能特異性毀損整個觸液神經元系統。藉此，張勵才創新利用靶向毀損觸液神經元系統技術，成功建立了缺失觸液神經元系統的大鼠和小鼠動物模型，為進一步深入探索觸液神經元系統的確切生物學意義提供了科學、可靠的方法學基礎。

張勵才表示：“近20年來，圍繞腦內觸液神經元的分布、定位、定性、信息傳遞的方向及其在某些生命活動中的作用，我們進行了持之以恒的研究和技術方法探索，并作出了獨到貢獻。特別是靶向毀損觸液神經元系統技術的創新應用，為項目設計、深化研究奠定了堅實基礎，開辟了廣闊的研究思路。”

感嘆：20年磨一劍

20年=1個設想+8個課題+72篇論文，這就是張勵才20年的研究苦旅。從最初的設想到獲得創新成果，張勵才的課題組先后獲得了8項國家級和省級課題的資助，累積發表論文72篇，其中SCI收錄20篇，國際引用120次，其中不乏《神經元》、《美國國家科學院院刊》等著名期刊。

歷經20年，張勵才和他的團隊在研究方面取得了一系列具有原創性、意義重大的進展，在實驗技術上，為國內外開展同類研究提供了科學可靠的方法學基礎和模式動物；在生命調控上，突破了神經與神經機體調控的傳統觀念，第一次揭示了“神經—腦脊液”新的機體調控通路，開辟人體調控關系的新視野；為認識生命調控規律，乃至某些疾病的發生、發展、預防和治療提供了新的診斷思維，提供了新的思考空間。

張勵才常說：“一個人不管從事什么工作，都要不斷地思考與創新，最關鍵的還在于實干。勞而無怨，終有所獲，怨而不勞，一無所有。”