雞主要組織相容性復合體I重鏈基因的克隆與序列分析

摘要：根據ＧｅｎＢａｎｋ中收錄的雞主要組織相容性復合體（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）Ⅰ的α胞外區基因核苷酸序列，設計并合成了一對引物，ＰＣＲ擴增α胞外區基因。將特異性ＤＮＡ條帶回收，以ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ質粒為載體進行連接，轉化大腸桿菌ＤＨ５α感受態細胞，經藍白斑篩選，菌液ＰＣＲ和酶切鑒定為陽性的重組子進行測序。測序結果表明，雞ＭＨＣⅠ的重鏈胞外區基因全長為８１０ｂｐ，包含一個完整開放的閱讀框，編碼２７０個氨基酸的多肽。試驗為進一步利用ＢＦ２的輕鏈基因在體外共同構建ＭＨＣⅠ類分子結合篩選抗原表位肽平臺奠定了基礎。

關鍵詞：雞；MHCⅠ類；重鏈；擴增；基因克隆；序列分析

中圖分類號：Ｓ８５２．４文獻標識碼：A文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０11）06-0007-04

主要組織相容性復合體（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）是Ｓｎｅｌｌ等在研究小鼠的移植排斥反應時發現的與免疫應答直接相關基因群編碼的一類細胞表面膜蛋白［１，２］。ＭＨＣ的主要免疫功能是識別、清除外來和內在抗原［３，４］。研究發現，雞的ＭＨＣ與許多重要疫病的抗性、易感性密切相關，為抗病育種提供了廣闊的研究領域。例如，它可極大地影響雞馬立克氏病（ＭＤ）的遺傳抗性［５］。細胞內的病毒抗原以及一些腫瘤抗原是內源性抗原，其遞呈工作主要由ＭＨＣⅠ類分子負責。ＭＨＣⅠ類分子由一條重鏈和一條輕鏈以非共價鍵形式結合組成。重鏈由ＭＨＣⅠ類分子基因編碼，成為α鏈。α鏈的胞膜外區分為α１、α２和α３三個區域。α１和α２區域形成一個由８個β折疊和２個α螺旋組成的兩端閉合的深槽，能與８～１０個氨基酸的多肽結合［６，７］。輕鏈是由另一條染色體的β２ｍ基因編碼。β２ｍ與α３區域以非共價鍵形式結合，其中α３區域氨基酸組成十分保守。細胞表面裝配好的ＭＨＣ復合體由三部分組成：含跨膜域和可變肽結合部位的重鏈、遞呈給Ｔ細胞受體的抗原性及既無跨膜域又無可變抗原結合域的輕鏈［２，８］。這３種成分是對于內源產生的肽抗原的裝配及其向Ｔ細胞的遞呈所必需的。雞內源性抗原均是由ＭＨＣⅠ類分子遞呈給免疫系統從而啟動機體的細胞免疫的，為更有效地獲得和認知雞的ＭＨＣⅠ類分子，研究抗原的遞呈機理，就需要在體外重建雞的ＭＨＣⅠ類分子。而α重鏈胞外區是ＭＨＣⅠ復合體的一個必不可少的成分，它的成功克隆為ＭＨＣⅠ類分子的體外重建奠定了基礎，為下一步重建ＭＨＣⅠ－抗原肽復合物，建立動物重大病原Ｔ細胞表位多肽的鑒定平臺提供必要的材料和支撐，從而可推進ＭＨＣⅠ類分子抗原遞呈的分子機理及表位疫苗的研究。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試驗地點、時間試驗地點：河南農業大學動物性食品安全實驗室；試驗時間：２０１０年９月３日至２０１１年２月１５日。

１．１．２菌種和質粒新鮮雞血液（用前采集）；ｐＧＥＭ -Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；大腸桿菌ＤＨ５α感受態細胞由河南農業大學動物性食品安全實驗室制備。

１．１．３工具酶、試劑及主要儀器ＡＭＶ反轉錄酶，ＩＰＴＧ（誘導劑）和Ｘ－ｇａｌ（生色底物），Ｔｒｉｚｏｌ試劑，Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ ＤＬ２０００，瓊脂糖，限制性內切酶ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ等購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物等為ＯＸＯＩＤ公司產品；ＤＮＡ提取試劑盒購自Ｖ－ｇｅｎｅ公司；ＤＮＡ凝膠回收試劑盒購自北京Ｔｉａｎｇｅｎ生物技術有限公司；質粒快速提取試劑盒購自北京博大泰克生物技術有限公司。

ＰＣＲ擴增儀（購自Ｍ Ｊ Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司），電泳系統（Ｂｉｏ－ＲＡＤ公司產品），小型臺式離心機（購自德國Ｓｉｇｍａ公司），超凈工作臺（購自蘇凈集團安泰公司）。

１．１．４常用溶液及培養基

氨芐青霉素（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，Ａｍｐ）貯存液：用ｄｄＨ２Ｏ將氨芐青霉素配成１００ｍｇ／ｍＬ，用０．２２μｍ的濾器過濾除菌，分裝成小份，－２０℃保存備用。

ＩＰＴＧ液：將２．０ｇ固體ＩＰＴＧ用８．０ｍＬ ｄｄＨ２Ｏ溶解，定容至１０ｍＬ，配成終濃度為１００ｍｇ／ｍＬ，用０．２２ μｍ濾器過濾除菌分裝成小份，于－２０℃保存備用。

Ｘ－ｇａｌ：用二甲基甲酰胺溶解固體Ｘ－ｇａｌ，使其濃度為２０ｍｇ／ｍＬ，保存于棕色瓶內或用鋁箔包裹的瓶內，貯存于－２０℃備用。

ＣａＣｌ２法轉化用溶液：６０ｍｍｏｌ ＣａＣｌ２，１５０ｍＬ甘油，１０ｍｍｏｌ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ值為７．０），加水至５００ｍＬ。

液體ＬＢ培養基（５００ｍＬ）：稱取酵母２．５ｇ，氯化鈉５ｇ，蛋白胨５ｇ，加５００ｍＬ去離子水后，加１００μＬ １０mol/L ＮａＯＨ，調ｐＨ值至7.4。使用時每１００ｍＬ加入６５μＬ配好的氨芐青霉素（１００ｍｇ／ｍＬ）。

固體ＬＢ培養基（１００ｍＬ）：稱取酵母０．５ｇ，氯化鈉１ｇ，蛋白胨１ｇ，瓊脂１．５ｇ，加１００ｍＬ去離子水后，加２０μＬ １０mol/L ＮａOＨ，調ｐＨ值至7.4。高壓滅菌后每１００ｍＬ加入６５μＬ配好的氨芐青霉素（１００ｍｇ／ｍＬ）。

１．２方法

１．２．１引物設計與合成參照ＧｅｎＢａｎｋ中發表的雞ＭＨＣⅠ的α胞外區基因，利用引物設計軟件ＰｒｅｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０設計１對引物，并用ＤＮＡｓｔａｒ、Ｐｃｒｄｅｓｎ、ＤＮＡｃｌｕｂ等軟件評價所設計引物。上下游引物之間所擴增片段長８１０ｂｐ。引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物Ｐ１：５’－ＧＡＧＣＴＣＣＡＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧ－３’；下游引物Ｐ２：５’－ＣＣＣＧＧＣＣＴＣＴＡＣＴＣＧＴＧＧ－３’

１．２．２ＲＮＡ的抽提取分裝于１．５ｍＬ EP管中的新鮮雞血液，加入４００μＬ的Ｔｒｉｚｏｌ，劇烈振蕩混勻。加入１００μＬ的氯仿／異戊醇（體積比２４∶１），劇烈振蕩混勻３０ｓ，臺式離心機上１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ。將上清液小心轉移到滅菌１．５ｍＬ Ｒｎａｓｅ－ｆｒｅｅ離心管里，加入１５０μＬ無水乙醇，混勻。將上述溶液全部轉移到套放于２ｍＬ收集管內的ＵｎｉＱ－１０柱中，室溫放置２ｍｉｎ，８ ０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｍｉｎ。小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子重新放回收集管中，加入４５０μＬ ＲＰＥ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（加４倍無水乙醇），室溫放置２ｍｉｎ，１０ ０００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｓ。重復一次，然后１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ空離３ｍｉｎ。加入１６μＬ ＤＥＰＣ水于柱內膜中央，７０℃水浴３ｍｉｎ。１２ ０００ｒ／ｍｉｎ室溫離心１ｍｉｎ洗脫，收集管內的溶液為ＲＮＡ樣品。提取的ＲＮＡ保存于－７０℃或直接用于第一條鏈ｃＤＮＡ的反轉錄。取５μＬ ＲＮＡ測定其濃度，另取５μＬ ＲＮＡ進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測其完整性。

１．２．３ＭＨＣ Ｉ 胞外區基因的克隆

１．２．３．１反轉錄按ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ的步驟進行，取上述提取的ＲＮＡ １１μＬ于一滅菌ＥＰ管中，加入１μＬ通用引物，７０℃溫浴１０ｍｉｎ，快速置冰上５ｍｉｎ，稍離心；然后依次加入５×反轉錄酶緩沖液４μＬ，ＲＮＡ酶抑制劑（２０Ｕ／μＬ）１μＬ，ｄＮＴＰ混合物２μＬ，加后稍離心，４２℃水浴２ｍｉｎ；最后快速加入Ｍ－ＭｕＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００U／μＬ）１μＬ繼續４２℃溫浴６０ｍｉｎ后于７０℃ １５ｍｉｎ滅活反轉錄酶，ＲＴ產物于－２０℃保存或立即進行ＰＣＲ。

１．２．３．２ＰＣＲ擴增采用Ｐ１／Ｐ２引物對對樣品進行ＰＣＲ擴增。在５０μＬ ＰＣＲ擴增體系中，加入以下成分：Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ酶２５μＬ，上、下游引物各１μＬ，ＤＮＡ模板６μＬ，補去離子水１７μＬ，混勻瞬時離心后進行ＰＣＲ擴增。反應程序為：９４℃ ５ｍｉｎ；９４℃ ３０ｓ，５１℃ ３０ｓ，７２℃ １ｍｉｎ，３０個循環；最后７２℃ ８ｍｉｎ。同時設立無模板的陰性對照。反應結束后，取５μＬ ＰＣＲ產物用１．０％瓊脂糖凝膠（含０．５μｇ／ｍＬ ＥＢ）進行電泳檢測ＰＣＲ的結果。

１．２．３．３回收ＰＣＲ產物參照ＧｅｎＣｌｅａｎ瓊脂糖凝膠ＤＮＡ回收試劑盒說明書，純化回收特異的ＤＮＡ條帶。具體操作如下：清洗電泳槽，更換電泳液，清洗紫外燈臺面及刀具。倒厚膠，點內側孔，切取最亮條帶，吸干水分，稱重。按１００μＬ膠塊加５００μＬ溶膠液的比例加入溶膠液，５５～６５°Ｃ水浴約１０ｍｉｎ，搖動數次，至膠塊完全溶解。將上述液體移至吸附柱中，放到離心機內按１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｓ，重復一次，然后去掉廢液。向吸附柱中加入５００μＬ漂洗液，

１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｓ，倒掉廢液。重復一次，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ空離２ｍｉｎ。移至１．５ｍＬ ＥＰ管中，加入３０μＬ洗脫緩沖液，室溫靜置１～２ｍｉｎ后，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ洗脫，封口于－２０°Ｃ保存。

１．２．３．４ＰＣＲ產物的連接將純化回收產物與ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ以７∶１比例進行連接，在１０μＬ連接體系中加入以下成分：２×Bｕｆｆｅｒ ５μＬ，回收產物３．５μＬ，ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ ０．５μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ連接酶１μＬ，待各組分加完后，于１６℃低溫連接過夜。

１．２．３．５工程菌ＤＨ５α感受態細胞的制備從３７℃培養１６～２０ｈ的ＬＢ平板中挑取一個單菌落，轉到一個含有１００ｍＬ ＬＢ培養基的三角燒瓶中，于３７℃劇烈振蕩搖床培養約３ｈ。在無菌條件下，將細菌轉到一個一次性使用的、用冰預冷的５０ｍＬ聚丙烯管中，在冰上放置１０ｍｉｎ，使培養物冷卻至０℃。４℃ ４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ以回收細胞。倒出培養基，將管倒置１ｍｉｎ，以使最后殘留的痕量培養液流盡。以１０ｍＬ預冷的０．１ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２重懸每份沉淀，放置于冰浴上。４℃ ４ ０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，以回收細胞。倒出培養液，將管倒置１ｍｉｎ以使最后殘留的痕量培養液流盡。每５０ｍＬ初始培養液用２ｍＬ冰預冷的０．１ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２重懸每份細胞沉淀。以每管１００μＬ分裝，－７０℃保存備用。

１．２．３．６連接產物的轉化取連接產物５μＬ無菌條件下加入４０μＬ感受態細胞中，混合振蕩均勻，冰浴放置３０ｍｉｎ；４２℃熱沖擊９０ｓ，迅速轉入冰浴維持１５ｍｉｎ；加９５０μＬ ＬＢ培養基，３７℃振蕩培養１ｈ。

８ ０００ｒ/min離心５ｍｉｎ，棄上清，再加入２００μＬ ＬＢ培養基重新懸浮沉淀；將菌液均勻涂布于含４２μＬ Ｘ－ｇａｌ、４２μＬ ＩＰＴＧ和氨芐青霉素（１００μｇ／ｍＬ）終濃度５０μｇ／ｍＬ的ＬＢ固體培養基待吸收（２０ｍｉｎ）后３７℃培養１２～１６ｈ。

１．２．３．７挑斑隨機挑取生長于ＬＢ平板上的數個白色菌落，分別接種于含Ａｍｐ的ＬＢ液體培養基中，３７℃振蕩過夜培養，同時設藍斑為陰性對照。

１．２．３．８重組質粒的菌液ＰＣＲ鑒定菌液ＰＣＲ反應體系如下：Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ酶２５μＬ，上游引物１μＬ，下游引物１μＬ，補去離子水１７μＬ，共４４μＬ，將４４μＬ分成兩份，然后每份加入３μＬ培養好的菌液，每份為２５μＬ，用２５μＬ體系進行ＰＣＲ擴增，然后電泳觀察。

１．２．３．９質粒的提取參照Ｂ型質粒小樣快速提取試劑盒的說明書提取質粒。從篩選平板上挑取單菌落于含抗生素的培養基中，３７°Ｃ振蕩培養１２～１６ｈ。取１．５～３．０ｍＬ菌液，室溫１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心３ｍｉｎ，倒掉培養基并將離心管倒扣于吸水紙上充分除去液體。用１００μＬ溶液１充分重懸細胞至管底沒有沉淀并且無塊狀懸浮。加入１５０μＬ溶液２，立即溫和上下顛倒５～６次，使菌體充分裂解，形成透明溶液。然后將離心管放到冰上１．５ｍｉｎ。加入１５０μＬ溶液３，立即溫和顛倒離心管數次，至蛋白絮狀沉淀不再增加。室溫靜置５ｍｉｎ，最后１４ ０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ。向一個新的吸附柱中加入４２０μＬ結合緩沖液，然后將上清液小心轉移至離心吸附柱中，盡量避免取到蛋白沉淀，混勻。室溫１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｓ，倒掉廢液收集管中的液體，將離心吸附柱裝回廢液收集管。重復一次。向吸附柱中加入７００μＬ漂洗液，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｓ，倒掉廢液并將離心吸附柱裝回廢液收集管。重復步驟一次。倒掉廢液后將離心吸附柱裝回廢液收集管中，空管１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ，以完全除去漂洗液。將吸附柱移至一個干凈的１．５ｍＬ離心管中，向吸附柱膜中央加入４０～６０μＬ洗脫緩沖液，室溫放置１～２ｍｉｎ，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ洗脫ＤＮＡ。（溶液１、２、３是Ｂ型質粒小樣快速提取試劑盒里提供的３種溶液。）

１．２．３．１０重組質粒的酶切鑒定用ＰｓｔⅠ對重組質粒進行酶切鑒定。在１０μＬ酶切體系中加入以下成分：１０×Bｕｆｆｅｒ １μＬ，重組質粒６μＬ，去離子水２μＬ，ＰｓｔⅠ１μＬ，混勻瞬時離心后，于３７℃水浴消化２ｈ，反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳檢查結果。

用ＥｃｏＲⅠ對重組質粒進行酶切鑒定。在１０μＬ酶切體系中加入以下成分：１０×Bｕｆｆｅｒ １μＬ，重組質粒６μＬ，去離子水２μＬ，ＥｃｏＲⅠ１μＬ，混勻瞬時離心后，于３７℃水浴消化２ｈ，反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳檢查結果。

１．２．３．１１基因的序列測定選擇酶切和ＰＣＲ鑒定均為陽性的重組菌液送往寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定。為避免因ＰＣＲ反應本身造成的序列錯誤，將目的基因均從正反兩個方向各測一遍，相互效驗無誤后，確定為雞ＭＨＣⅠ的α胞外區基因序列。

２結果

２．１ＰＣＲ擴增

從新鮮雞血液中提取總ＲＮＡ，然后利用ＲＴ－ＰＣＲ技術擴增產物，經１％瓊脂糖凝膠電泳初步檢測表明，在８１０ｂｐ左右出現了一條特異性條帶，與預期大小相符（圖１）。

２．２重組質粒的酶切鑒定

提取菌液ＰＣＲ鑒定為陽性重組菌的質粒，分別用ＰｓｔⅠ和ＥｃｏＲⅠ進行酶切鑒定。ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ質粒的大小為３ ０００ｂｐ，并有兩個ＥｃｏＲⅠ和一個ＰｓｔⅠ酶切位點，目的片段大小約８１０ｂｐ。重組質粒經ＥｃｏＲⅠ酶切、電泳應出現２條帶：一條大小約３ ０００ｂｐ的帶，而另一條為約８１０ｂｐ的帶；經ＰｓｔⅠ酶切在

３ ８１０ｂｐ左右出現一條特異性條帶，與預期結果相符（圖２）。表明獲得了基因的重組質粒，陽性重組質粒命名為ｐＧＥＭ－α。

２．３序列分析

選擇酶切和ＰＣＲ鑒定為雞ＭＨＣⅠ的α胞外區基因重組陽性的菌液送寶生物工程（大連）有限公司，進行正反兩個方向的序列測定，報告的核苷酸序列為８１０ｂｐ，包含一個完整開放的閱讀框（８１０ｂｐ），共編碼含２７０個氨基酸的成熟多肽。

３討論

ＭＨＣⅠ類分子是機體細胞膜表面的糖蛋白，ＭＨＣ分子的主要功能是幫助特異分子片段以易于被免疫效應細胞（如Ｔ淋巴細胞）識別的排列呈現在細胞表面。它們實際上起著結合和識別抗原的作用［９］，ＭＨＣ分子通過其結合肽和同Ｔ細胞的相互作用的分子功能來實現其免疫學作用，ＭＨＣⅠ類分子結合肽是有選擇性的，病毒的Ｔ細胞抗原表位是ＭＨＣⅠ類分子限制性的［１０］。ＭＨＣⅠ類分子主要遞呈內源性抗原，正是由于ＭＨＣⅠ類分子對大量的內源性抗原的遞呈，才使得機體特異性識別內源性抗原，從而激發機體的特異性的細胞免疫，究竟一個病毒或者其他的內源性抗原蛋白有多少細胞表位是供ＭＨＣⅠ類分子識別的，其中哪些表位是主要的優勢表位，哪些表位是必須的優勢表位，目前在國際上對表位的探索和篩選由于缺乏有效體外鑒定系統而進展緩慢，此外多肽表位的遞呈是ＭＨＣ限制性的，不同的個體由于其不同的ＭＨＣⅠ，所以其遞呈抗原的能力和類別就可能存在差異。

為在國際上率先探索開發一種Ｔ細胞表位快速篩選和鑒定技術，本實驗為體外鑒定Ｔ細胞表位平臺的建立提供必要的ＭＨＣⅠ類分子的重鏈，對重鏈胞外區基因進行了成功克隆。進一步為ＭＨＣⅠ重鏈和輕鏈的聯合表達載體系統的選擇提供了強有力的證據，為動物重大病原的表位多肽鑒定平臺的進一步建立提供了必要材料和支撐。

參考文獻：

［１］ＢＲＩＬＥＳ Ｗ Ｅ，ＭCＧＩＢＢＯＮ Ｗ Ｈ，ＩＲＷＩＮ Ｍ Ｒ．Ｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｌｅｌｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ［Ｊ］． Ｇｅｃｎｅｔｉｓ，１９５０，３５（６）：６３３－６５２．

［２］ＢＪＯＲＫＭＡN Ｐ Ｊ，ＳＡＰＥＲ Ｍ Ａ，ＳＡＭＲＡＯＵＩ Ｂ，ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ－Ａ２［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ， １９８７，３２９：５０６－５１２．

［３］ＭＩＬＬＥＲ Ｍ Ｍ，ＢＡＣＯＮ Ｌ Ｄ，ＨＡＬＡ Ｋ，ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｎｏｎｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ（Ｂ ａｎｄ Ｙ） ｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，５６（４）：２６１－２７９．

［４］ＶＹＳＥ Ｔ Ｊ，ＴＯＤＤ Ｊ Ａ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ，１９９６，８５（３）：３１１－３１８．

［５］金元昌，韋平． 雞ＭＨＣⅠ多態性與馬立克氏病遺傳抗性相關性的研究進展［Ｊ］．中國家禽，２００８（２）：３４－３７．

［６］ＳＰＥＩＲ Ｊ Ａ，ＡＢＤＥＬ－ＭＯＴＡＬ Ｕ Ｍ，ＪＯＮＤＡＬ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ［Ｊ］． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９９，１０（１）：５１－６１．

［７］ＳＩＬＶＥＲ Ｍ Ｌ，ＰＡＲＫＥＲ Ｋ Ｃ，ＷＩＬＥＹ Ｄ Ｃ． Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｂｙ ＭＨＣ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆＨＬＡ－Ａ２ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５０：６１９－６２２．

［８］ＹＯＫＯＹＡＭＡ Ｋ，ＮＡＴＨＥＮＳＯＮ Ｓ Ｇ． Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｈ－２ ＭＨＣ ａｎｔｉｇｅｎｓ；ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｅｔａ ２ ｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ－２ Ｋｂ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８３，１３０（３）：１４１９－１４２５．

［９］ＣＯＬＥＳ Ｒ Ｍ，ＪＯＮＥＳ Ｃ Ｍ，ＢＲＯＯＫＳ Ａ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｘｐａｎｄｓ ａ ｂｉａｓｅｄ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，３３（６）：１５５７－１５６７．

［１０］李新生，陳紅英，閆若潛，等．禽流感病毒Ｔ細胞表位與體外重建雞ＭＨＣⅠ類分子結合試驗［Ｊ］．畜牧獸醫學報，２００７（１２）： ６５－７０．