陳皮純化物\\原花青素\\兒茶素及其組合物的抗氧化性比較研究

摘要：用熒光光度法考察陳皮純化物、原花青素、兒茶素及其組合物對·OH和蒽的清除能力。他們對·OH的IC50值分別為：0.190、0.080和 0.088g/L，對蒽的IC50值分別為0.070、1.084和1.019g/L。用正交試驗方法來優化其的組合，發現清除·OH的最佳組合是陳皮純化物：原花青素：兒茶素為1：2：2；清除蒽的最佳組合為2：1：2。

關鍵詞：陳皮純化物 原花青素 兒茶素 抗氧化性

自由基與免疫性疾病和心血管疾病等的發生密切相關[1]。自由基和多環芳烴及其氧化產生的中間產物能夠傷害生物膜、維生素、蛋白質及活細胞，已明確許多疾病都與自由基和多環芳烴有關[2-3]。但目前的研究主要考察在一定溫度下抗氧化劑對自由基或多環芳烴抗氧化能力的影響。許多植物的有效成份是天然的強抗氧化劑，有很強的清除自由基和多環芳烴的能力[4]。陳皮黃酮、原花青素和兒茶素有很強的清除自由基和多環芳烴的能力[5-6]。抗氧化活性取決其獨特的分子結構及分子中大量的酚羥基[7-9]。但對這三種物質的抗氧化性的綜合性研究未見報道。論文研究了溫度、時間對其抗氧化能力的影響，通過正交實驗考察了其分別對·OH和蒽清除的最佳配比，為天然抗氧化劑的開發提供理論依據。

1 實驗方法

1.1 三種抗氧化劑分別對·OH的清除

1.1.1 清除·OH的測定：用Fenton反應(H2O2／Fe2+反應體系)產生·OH，羥苯甲酸可發熒光，往體系中加入苯甲酸捕獲過量·OH生成羥苯甲酸，檢測羥苯甲酸的熒光強度考察抗氧化劑對·OH清除作用。比色管中依次加入磷酸緩沖液(PH=7.0)2mL，10mmoL/L Fe+2-EDTA(1:1)溶液1mL，30mmoL/L苯甲酸10mL，乙醇-抗氧化劑(8mL)，最后加入20mmoL/L H2O20.5mL啟動反應，在50或70℃、300nm(Ex)/408nm(Em)條件下測量熒光強度。清除率按下面公式計算：

清除率(%）=(F0-Fs)/F0×100% （*）

（F0：不含抗氧化反應液的熒光強度；Fs：含抗氧化反應液的熒光強度）

1.1.2 依1.1.1設計體系(熒光強度至不再變化作為反應完全的標志，間隔檢測時間為10min)考察反應溫度(30、50、70℃)、抗氧化劑濃度、時間對清除反應的影響及計算清除率。

1.2 三種抗氧化劑分別對蒽的清除

1.2.1 體系設計：利用多環芳烴(蒽)熒光強度的變化考察陳皮黃酮對多環芳烴的清除作用。在比色管中依次加入0.3mg/L蒽5mL，乙醇—抗氧化劑(共5mL)反應，分別在50和70 ℃下一定時間后，在355nm(Ex)/398nm(Em)條件下測量蒽的熒光強度。

1.2.2 反應溫度、時間、抗氧化劑濃度對清除反應的影響：反應體系(抗氧化劑濃度為：0.151g/L)，在一定溫度下反應一定時間后測量熒光強度至熒光強度不再變化。

1.3 三抗氧化劑協同抗氧化性的研究：設計3因素2水平正交實驗L4(23)考察氧化劑組合對蒽和·OH的清除，再據正交結果得出他們對蒽和·OH清除的最佳質量組合。

2 結果與討論

2.1 三種抗氧化劑分別對·OH的清除

2.1.1 反應溫度、時間對清除反應的影響

不同溫度三種抗氧化劑對·OH清除的熒光動力學曲線如圖1（A）。在反應的開始階段熒光強度不斷升高，到一定值時基本不變，認為此時清除完全。當體系為30、50、70℃時，陳皮黃酮體系完全反應時間分別約為180、90和40min；葡萄籽原花青素分別為：120、60和40min。而兒茶素三曲線基本重合，溫度對兒茶素抗氧化性影響不大，完全反應的時間為70min。造成各體系完全反應時間不同的原因是各抗氧化劑給出質子能力不同引起的。

2.1.2 抗氧化劑濃度、反應溫度對清除反應的影響

抗氧化劑濃度、反應溫度對·OH清除的影響見圖1（B）。三種抗氧化劑對·OH均有較強的清除能力。當溫度升高陳皮黃酮和原花青素的抗氧化性均有一定程度的提高，而兒茶素基本維持不變。當30℃時他們對·OH的IC50值分別為：0.296、0.105和0.175g/L；50℃時分別為：0.220、0.105和0.109g/L；70℃時分別為：0.170、0.105和0.045g/L。

2.2 反應溫度、抗氧化劑濃度對清除蒽的影響

2.2.1 反應溫度、時間對清除反應的影響

不同溫度三種抗氧化劑對蒽清除熒光動力學曲線如圖1（C）。在間隔檢測時間前熒光強度已達最大值，可認為清除反應在檢測前10min內已完全反應，溫度對清除蒽的影響很小。

2.2.2 抗氧化劑濃度、反應溫度對清除率的影響

由圖1（D）可知，陳皮黃酮、兒茶素和葡萄籽原花青素對蒽均有較強的清除能力，清除能力為：陳皮黃酮＞原花青素＞兒茶素。溫度的變化對其清除蒽的影響不大，對蒽的IC50值分別為：0.104、0.912和0.225g/L。

2.3 正交分析

設計正交實驗考察抗氧化效果，結果如表1，對清除·OH兒茶素的濃度越高清除效果越好，當陳皮黃酮，葡萄籽原花青素和兒茶素以1：2：2的質量比進行組合時清除效率最佳，對蒽進行清除時陳皮黃酮起主要作用的清除作用，它們對蒽清除的最佳質量組合為2：1：2。

2.4 三抗氧化劑協調作用的研究

陳皮黃酮、葡萄籽原花青素、兒茶素及其組合物對·OH和蒽的清除結果見圖2，清除·OH的能力順序為：b＞c＞a；清除蒽的能力順序為：a＞c＞b。四種組合抗氧化劑對·OH和蒽的清除能力均介于清除能力最強和最弱的二抗氧化劑間，即組合物間有一定的協同抗氧化性。

3 結論

3.1 溫度升高陳皮黃酮和葡萄籽原花青素對·OH的清除效果增強。溫度對陳皮黃酮和葡萄籽原花青素的抗氧化有較大的影響，而對兒茶素的影響不大。三抗氧化劑對蒽的清除反應快，反應時間短，其清除能力順序為：陳皮黃酮＞原花青素＞兒茶素。

3.2 當陳皮黃酮、葡萄籽原花青素和兒茶素以1：2：2的質量比組合時對·OH進行清除時效果最好；對蒽進行清除時則以2：1：2進行組合最理想。

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