雙歧桿菌凍干菌粉制備過(guò)程中保護(hù)劑的研究

李德斌，趙敏

（東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

雙歧桿菌凍干菌粉制備過(guò)程中保護(hù)劑的研究

李德斌，趙敏

（東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

對(duì)雙歧桿菌真空冷凍干燥過(guò)程中使用的各種保護(hù)劑進(jìn)行了研究，在各種保護(hù)劑中篩選出4種效果比較好的類型，配合成復(fù)合保護(hù)劑，在很大程度上提高了雙歧桿菌在凍干過(guò)程中的活菌存活率，達(dá)到71.11%的存活率。最后還進(jìn)行了常溫和低溫保存實(shí)驗(yàn)。

雙歧桿菌；計(jì)數(shù)方法；保護(hù)劑

0 引 言

雙歧桿菌（Bifidobacterium）最初是由法國(guó)巴斯德研究所的 Henry Tissier（1899年）從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離得到的，具有較好的保健作用，是目前益生菌制品中非常重要的品種之一[1，2]。但現(xiàn)在市售的雙歧桿菌活菌制品存在一個(gè)最為關(guān)鍵問(wèn)題，就是產(chǎn)品在貯存和銷售過(guò)程中活菌數(shù)量會(huì)大量下降，導(dǎo)致效用降低，不能達(dá)到預(yù)期的目的。真空冷凍干燥技術(shù)[3]是目前微生物菌種保藏的主要應(yīng)用技術(shù)之一，當(dāng)微生物通過(guò)冷凍過(guò)程時(shí)，其體內(nèi)的水分快速蒸發(fā)掉，只保持最低的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，使其生理活動(dòng)降低到最低程度，以增加微生物的壽命，延長(zhǎng)其保藏期。所以將雙歧桿菌制成凍干的菌粉[4]，延長(zhǎng)其保存時(shí)間，是目前生產(chǎn)上常用得手段之一。

在凍干工藝中，低溫和水分蒸發(fā)會(huì)對(duì)雙歧桿菌造成很大的傷害。如果直接冷凍雙歧桿菌菌液，會(huì)使雙歧桿菌的活菌數(shù)目大幅度下降。為了提高在凍干過(guò)程中雙歧桿菌的存活率，向雙歧桿菌菌液中加入保護(hù)劑是一種非常有效的方法。保護(hù)劑的種類有很多，一般用多羥基醇、多糖等物質(zhì)。

1 試 驗(yàn)

1.1 材料

試驗(yàn)菌種：菌種編號(hào)為1.1852。

培養(yǎng)基：采用牛奶還原培養(yǎng)基和PTYG[5]培養(yǎng)基，其中PTYG作為菌種保存和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基使用，有生成的菌落形態(tài)規(guī)整、易于生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。

計(jì)數(shù)方法采用雙層平板計(jì)數(shù)方法[6，7]。

1.2 單一保護(hù)劑

1.2.1 保護(hù)劑的選擇與配置

選擇乳糖、可溶性淀粉、甘油、谷氨酸、蔗糖、葡萄糖和海藻糖7種保護(hù)劑。首先將其配置成一定濃度的母液，備用。

1.2.2 單一保護(hù)劑的添加

（1）菌液的生產(chǎn)。用無(wú)菌的移液管將1 mL雙歧桿菌菌液在無(wú)菌操作下，接入裝有30 mL牛奶還原培養(yǎng)基中，接種量約為3%，然后放入?yún)捬跸鋬?nèi)恒溫培養(yǎng)32 h。

（2）保護(hù)劑的加入。將預(yù)先配好一定濃度的保護(hù)劑加入(見(jiàn)表1)到培養(yǎng)好的牛奶還原培養(yǎng)基中，混合均勻，同時(shí)用雙層培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)雙歧桿菌菌液中雙歧桿菌的活菌數(shù)[8]。

（3）預(yù)凍。提前將安培瓶刷洗干凈，用報(bào)紙包好后在160℃下滅菌1 h。吸2 mL加好保護(hù)劑的雙歧桿菌菌液注到無(wú)菌安培瓶中，在-20℃的冰箱中預(yù)凍。

（4）凍干。把預(yù)凍好的安培瓶放入超低溫真空冷凍干燥機(jī)，到成為干粉狀。

表1 單一保護(hù)劑的加入量及最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)

（5）封口。將裝有冷凍好的雙歧桿菌干菌粉的安培瓶，用酒精噴燈把安培瓶瓶口的玻璃燒化封好。

（6）冷藏。安培瓶封好后，放入-50℃冰箱中冷藏，待測(cè)。

1.3 復(fù)合保護(hù)劑

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇保護(hù)作用較好的葡萄糖、海藻糖和可溶性淀粉等來(lái)配置復(fù)合保護(hù)劑。

1.3.1 復(fù)合保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

根據(jù)單一保護(hù)劑的作用效果來(lái)選擇復(fù)合保護(hù)劑的種類及濃度，具體情況如表2。

表2 復(fù)合保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇情況

1.3.2 復(fù)合保護(hù)劑的添加

方法同單一保護(hù)劑的試驗(yàn)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑對(duì)活菌率的影響

通過(guò)測(cè)定雙歧桿菌菌液在真空凍干干燥前后雙歧桿菌活菌數(shù)目，來(lái)對(duì)比單一保護(hù)劑對(duì)雙歧桿菌的保護(hù)作用，具體情況如表3所示。由表3中可以看出：

（1）本研究所采用的7種保護(hù)劑，共14種處理對(duì)雙歧桿菌的凍干過(guò)程均有一定的保護(hù)作用。

表3 真空冷凍干燥前后雙歧桿菌活菌數(shù)目對(duì)照

（2）在所有的保護(hù)劑及各種處理中，以葡萄糖（10%）作為保護(hù)劑時(shí)，活菌存活率（32.5%）最高，依次為谷氨酸（0.5%）、甘油（1%）、海藻糖（0.6%）、海藻糖（1.2%）、乳糖（1%）等。

（3）在雙歧桿菌菌液中加入保護(hù)劑的14種處理中，活菌存活率最低的是加入蔗糖（4%），其活菌存活率是5.42%，它也要比空白（不加入任何保護(hù)劑）的活菌存活率（2.5%）高一倍左右。而活菌率最高(葡萄糖10%)是空白的活菌率的13倍左右。

復(fù)合保護(hù)劑對(duì)活菌率的影響如表4所示。

表4 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)活菌率的影響

由表4中得到如下結(jié)論：

（1）復(fù)合保護(hù)劑與單一保護(hù)劑相比，具有明顯的增強(qiáng)作用，可以顯著提高雙歧桿菌在真空冷凍干燥過(guò)程中的活菌存活率。

（2）這10種復(fù)合保護(hù)劑的處理中，以9號(hào)（甘油+葡萄糖+海藻糖）處理的活菌率最高，為71.11%；比單一保護(hù)劑處理時(shí)最好的保護(hù)效果（32.5%）提高近40個(gè)百分點(diǎn)；10號(hào) （蔗糖+葡萄糖+海藻糖），活菌百分率是62.22%，也是比較理想的。最低的效果（12.00%）也比單一保護(hù)劑的最低效果（5.42%）提高2倍多。

2.2 常溫下凍干菌粉的活菌率

含有雙歧桿菌的生物制品的一個(gè)重要缺陷，就是常溫保存時(shí)活菌數(shù)下降過(guò)快。所以測(cè)定雙歧桿菌凍干菌粉在常溫保存時(shí)，活菌數(shù)目的變化情況對(duì)產(chǎn)品具有重要的意義。選擇具有代表性的4℃和25℃作為測(cè)定溫度更具有普遍意義。

表5 常溫保存對(duì)活菌數(shù)的影響

由表5可以看出：

（1）雙歧桿菌凍干菌粉無(wú)論在4℃和25℃保存下，其活菌數(shù)目都會(huì)下降，但是在4℃保存下，下降的趨勢(shì)比較緩慢，一般在10 d后下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，而在25℃保存下，下降劇烈，5 d時(shí)測(cè)定其活菌數(shù)目時(shí)，就已經(jīng)下降一個(gè)數(shù)量級(jí)；

（2）使用復(fù)合保護(hù)劑比使用單一保護(hù)劑的雙歧桿菌凍干菌粉中的活菌數(shù)，在相同的條件下，要高很多。

（3）不添加保護(hù)劑時(shí)，25℃保存，在10 d左右雙歧桿菌活菌數(shù)就已經(jīng)微乎其微了，到第15 d時(shí)，就已經(jīng)檢測(cè)不到了；4℃保存略好，但也不過(guò)延長(zhǎng)5 d而已。

（4）添加單一保護(hù)劑時(shí)，25℃保存，可以保持較高的活菌數(shù)到10 d左右，15 d后，含量急劇下降，甚至檢測(cè)不到；4℃保存，可以順延5 d。

（5）添加復(fù)合保護(hù)劑時(shí)，效果最好，4℃可以保持較高的活菌數(shù)到25 d左右；25℃下，也可以到15 d。

（6）添加保護(hù)劑雖然可以適當(dāng)延長(zhǎng)雙歧桿菌凍干菌粉的保質(zhì)期，但對(duì)于商業(yè)上的應(yīng)用還是不夠的，所以還應(yīng)該采取一些適當(dāng)措施來(lái)提高含有雙歧桿菌的生物制品的保質(zhì)期來(lái)提高產(chǎn)品的質(zhì)量，如制成腸溶性微膠囊。

3 討 論

雙歧桿菌制品長(zhǎng)期以來(lái)，一直難以克服的困難就是如何保持其具有較高的活菌數(shù)的問(wèn)題。現(xiàn)在一般采用膠囊或者微膠囊后密封保存的方式[9]，而生產(chǎn)這些產(chǎn)品的基礎(chǔ)就是生產(chǎn)出具有較高活菌數(shù)的凍干菌粉來(lái)。所以較好的凍干菌粉工藝是發(fā)展雙歧桿菌制品的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)在雙歧桿菌凍干過(guò)程中加入各種保護(hù)劑來(lái)提高雙歧桿菌的存活率，從而生產(chǎn)出具有較高活菌數(shù)的雙歧桿菌制品。在凍干過(guò)程中加入了常見(jiàn)的各種凍干保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn)單一的保護(hù)劑的效果還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果，效率最好的葡萄糖（10%）也不過(guò)是32.5%，而通過(guò)加入多種保護(hù)劑，可以達(dá)到更好的效果，可以達(dá)到71.11%，這樣就會(huì)更好地滿足生產(chǎn)上的要求。

[1]丁可,余倩.雙歧桿菌檢測(cè)方法進(jìn)展研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2004,31(5):723-727.

[2]李德斌，趙敏，張靜.雙歧桿菌與微生態(tài)制劑.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志.2003,15（6），371～372.

[3]CARVALHO A S,SILVA J,HO P,et al.Survival of Freeze-Dried Lacto-Bacillus Plantarum and Lactobacillus rhamnosus during Storage in the Presence of Protectants[J].Biotechnology Letter,2002,24(19):1587-1591.

[4]邵偉,樂(lè)超銀,熊譯,等.雙歧桿菌凍干粉制備工藝研究 [J].現(xiàn)代品科技,2008,21(4):54-56.

[5]杜連祥,趙征.乳酸菌及其發(fā)酵制品生產(chǎn)技術(shù) [M].天津:科學(xué)技術(shù)出版社,1999.

[6]劉偉，李德斌，高利.雙歧桿菌計(jì)數(shù)方法的研究[J].食品科技，2010,35(9):34-36.

[7]王立平.最大可能數(shù)法計(jì)數(shù)乳品中雙歧桿菌數(shù)量的研究[J].食品科技，2011,36(5):260-2 63.

[8]許燕濱,謝光炎,楊汝德,等.雙歧桿菌微膠囊熱穩(wěn)定性研究 [J].廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,18(4):86-88.

[9]PICOT A,LACROIX C.Effects of Micronization on Viability and Thermotolerance of Probiotic Freeze-Dried Cultures[J].International Dairy Journal,2003,13(6):455-462.

Study on protectant of freeze-drying Bifidobacterium powder in the preparation process

LI De-bin，ZHAO Min
(Northeast Forestry University,Harbin 150040，China)

All kinds of protectants were studied under the freeze-dry condition and four types of protectants,which have good effect,were screened out.The four protectants were mixed together forming the multiplex-protectant which can promotes the survival probability of bifidobnacterium on the process of freeze-dry greatly,the survival rate reached 71.11%.Finally,also carried out at room temperature and cold storage experiments.

Bifidobacterium;count method;protectant

Q93-335

A

1001-2230（2011）11-0032-03

2011-07-01

李德斌（1976-），男，工程師，從事微生物應(yīng)用方面研究。