鹽酸多西環素對重組質粒 pBI-EGFP-hHO-1表達的調控

楊 婧 張海風 王 媛 趙 勤 張新勝 單 杰

(鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室,河南 鄭州 450001)

癌癥已經成為威脅人類健康的一大重要疾病,目前通常采用化療、放療、手術切除等方法進行癌癥的治療。但是癌癥的治療一般都很困難,并且預后不佳〔1〕。血色素氧化酶-1(HO-1)是哺乳動物細胞中廣泛存在的一種可誘導酶,它是血色素在機體內被降解過程中的限速酶〔2〕,具有抗氧化,抗凋亡等效應,是細胞內重要的保護酶類,并與腫瘤的發生發展有很大關系。有研究表明在大部分癌癥組織里,HO-1蛋白表達變得很高〔3〕,同時機體內對抗外界氧化作用的其他酶如超氧化物歧化酶(SOD)、超氧化氫酶 (CAT)等的表達和活效都有或高或低的下降〔4,5〕。這說明 HO-1在癌癥的發生發展過程中可能起到了保護癌細胞的作用。Tet-off調控系統具有效能高、毒副作用小,并有嚴謹“開關”功能的優點,能夠表達連接在其上的目的基因?？赏ㄟ^四環素類和鹽酸多西環素〔強力霉素類 (Dox)〕藥物對該系統進行誘導。前期的研究中構建 HO-1的真核表達載體,但該表達載體并不能人為地有效調控目的基因的表達。本實驗采用 Tet-off調控表達系統載體,構建一個能夠人為調控目的基因 HO-1表達的真核表達載體 pB I-EGFP-hHO-1,為后續實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 限制性核酸內切酶 NheⅠ、MluⅠ(Freg Ments公司產品);限制性核酸內切酶 HindⅢ、BamHⅠ、Marker DL2000、10×Loading buffer、T4 DNA連接酶、核酸膠回收試劑盒 (TaKa-Ra公司產品);質粒小量提取試劑盒 (AxyPrep公司產品);Taq DNA聚合酶、dNTP、lipofectamine2000脂質體轉染試劑、TR IZOL Reagent(Invitrogen公司產品);RPM I1640培養粉 (G IBCO公司產品);胰蛋白酶 (Sigma公司產品);小牛血清 (杭州四季青公司);cDNA第一鏈合成試劑盒 (B IORED公司產品);兔抗人HO-1多克隆抗體、兔抗人β-Actin抗體 (SANTA CRUZ產品);S-P免疫組化試劑盒 (中杉金橋生物工程公司);鹽酸多西環素(江蘇聯環藥業股份有限公司);質粒 pcDNA3.1-hHO-1、質粒pB I-EGFP、質 粒 pTet-off(由 本 室 保 存);細 菌 菌 株(E.Coli.DH5α)(由本室保存 );人肝癌 (S MMC7721)細胞系(由本室保存)。

1.2 方法

1.2.1 質粒 pB I-EGFP-hHO-1的構建 將本室保存的含有質粒 pcDNA3.1-hHO-1的 E.Coli.DH5α劃板過夜,挑取單個菌落于 50 mlLB培養基中,37℃搖床培養過夜,提取質粒,用 HindⅢ和 BamHⅠ雙酶切得到 HO-1小片段,電泳鑒定為約 800 bp。之后取上述 pcDNA3.1-hHO-1質粒作為 PCR擴增模板,在引物中添加 NheⅠ和MluⅠ酶切位點擴增 HO-1片段,電泳后回收。用NheⅠ和 MluⅠ雙酶切 37℃分別處理回收的片段和質粒 pB IEGFP,瓊脂糖凝膠電泳后分別膠回收 pB I-EGFP大片段和HO-1小片段。純化后將片段在 T4連接酶作用下進行連接。連接產物轉化感受態細菌。提取重組質粒后用 NheⅠ/MluⅠ雙酶切鑒定。

1.2.2 重組質粒 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細胞 S MMC-7721中的表達

1.2.2.1 細胞培養及轉染 使用含 10%小牛血清的 RPM I1640培養基,將肝癌 S MMC-7721細胞在 37℃,5%CO2培養箱中培養。以適當密度接種在 25 ml培養瓶中,待細胞貼壁后密度達到 90%～95%時,使用 lipofectamine2000脂質體按照說明書將重組質粒轉染進轉染組。

1.2.2.2 RT-PCR鑒定重組質粒 pB I-EGFP-hHO-1表達 以適當密度接種在 25 ml培養瓶中,分為三組：①陽性對照即未轉染質粒組。②轉染空載質粒 pB I-EGFP、Tet-off組。③轉染重組質粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off組。轉染后 48 h分別提取細胞總RNA。使用B IORED公司 cDNA第一鏈合成試劑盒合成 cDNA第一鏈。取上述產物 2μl作為 PCR擴增模板,設計特異性引物擴增 HO-1基因序列中約 110 bp特異片段,同時擴增內參對照β-actin片段,2%瓊脂糖凝膠電泳,分析 RT-PCR擴增結果。1.2.2.3 免疫細胞化學鑒定 Tet-off調控的 pB I-EGFP-hHO-1的蛋白表達 細胞以適當密度接種在 25 ml培養瓶中,分為四組①未轉染質粒組,②轉染質粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off組。①、②組又分別設立其陰性對照組①-a、②-a(即由 PBS取代第一抗體)。待轉染 48 h后,做免疫細胞化學。光電顯微鏡下觀察免疫細胞化學結果。

1.2.3 不同濃度鹽酸多西環素誘導 Tet-off調控的 pB I-EGFP-hHO-1在細胞中的表達 待細胞貼壁,密度達到 90%～95%,將25 ml培養瓶中細胞分別標記為 1～9號,將 Tet-off和 pB I-EGFP-hHO-1共轉染進肝癌 S MMC-7721細胞,24 h后分別加入不同濃度的鹽酸多西環素溶液 ,依次為：1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、3 000 ng/ml。48 h后分別提取細胞總 RNA,同時提取 1瓶未轉染細胞作 RT-PCR,2%瓊脂糖凝膠電泳分析結果。

2 結 果

2.1 質粒 pB I-EGFP-hHO-1的構建 NheⅠ/MluⅠ雙酶切重組質粒后電泳可見約 5 100 bp及約 866 bp條帶,與質粒 pB IEGFP及 HO-1基因序列長度相一致。說明已將質粒 pB I-EGFP-hHO-1構建成功。見圖1。

圖1 重組載體質粒 pBI-EGFP-hHO-1酶切鑒定結果

2.2 重組質粒 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細胞 S MMC-7721中的表達

2.2.1 RT-PCR鑒定重組質粒 pB I-EGFP-hHO-1表達 以βactin mRNA的表達作為內參對照,檢測三組 HO-1的 mRNA的表達：①未轉染質粒的陰性對照組;②轉染 pB I-EGFP、Tet-off空質粒組;③轉染質粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off組。結果顯示：以內參引物為引物經 RT-PCR擴增后可見約 427 bp電泳條帶,半定量分析三組細胞中β-actin mRNA表達在凝膠電泳圖條帶亮度上無顯著差異,這說明三組細胞提取的總 RNA量相等。以特異性引物經 RT-PCR擴增后見到約 110 bp電泳條帶,且③組的 HO-1特異片段的mRNA比①、②組明顯增高?？膳袛嗨沫h素調控 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off系統在肝癌細胞 S MMC7721中 HO-1 mRNA的表達增高。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測 HO-1基因 mRNA在SMMC-7721細胞中的表達

2.2.2 免疫細胞化學鑒定 Tet-off調控的 pB I-EGFP-hHO-1的蛋白表達 ①-a、②-a細胞上未見棕紅色染色。①、②組細胞均有紅棕色,且②組中一部分細胞紅棕色染色明顯深于①組。說明 Tet-Off調控的 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細胞 S MMC7721中 HO-1蛋白質的表達增高。見圖3。

2.3 不同濃度鹽酸多西環素誘導 Tet-off調控的 pB I-EGFP-hHO-1在細胞中的表達 檢測 10組 HO-1mRNA的表達。①未轉染質粒陰性對照組②-⑩分別為轉染質粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off 24 h后加入 1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、3 000 ng/ml鹽酸多西環素溶液組。結果顯示：當鹽酸多西環素溶液濃度達到 2 000 ng/ml時轉染質粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off組的 HO-1含量接近陰性對照組,即 Tet-off調控得 pB I-EGFP-hHO-1的鹽酸多西環素誘導濃度為 2 000 ng/ml。見圖4。

圖3 免疫細胞化學檢測 HO-1蛋白質在 SMMC-7721細胞中的表達

1～11：1,5,10,50,100,500,1 000,2 000,3 000 ng/ml多西環素組 ;未轉染質粒組;Marker

3 討 論

HO-1在機體遭遇機體氧化或應對外界刺激的時候保護細胞,但恰恰這種保護作用在化學藥物治療或射線放射治療癌癥時,HO-1卻變成了癌細胞的保護酶,使療效降低甚至失去療效。當腫瘤治療達到恢復階段時,化學藥物治療和放射射線治療產生的氧化自由基會繼續作用于機體的正常健康細胞,如果這些氧化自由基不能及時清除,癌癥患者會恢復緩慢甚至誘發新的腫瘤,如果在適當的時候能夠增強 HO-1的表達,就可以保護正常細胞。鑒于以上種種,本文試圖找到安全有效的方法來調控 HO-1的表達。

本實驗采用的 Tet-off系統,是目前應用最廣泛的誘導性基因表達系統,它具有在機體內外都能進行基因表達調控的優點〔6〕,可以用于原核生物體,真核生物體模型。其誘導物四環素類和強力霉素類價格低廉,毒性小,使其正逐漸成為一種較為理想的誘導性基因表達系統。該系統包含調控質粒和應答質粒,調控質粒 Tet-off,質粒中含有一個融合的轉錄活化因子結構 tTA,該因子由細菌的四環素阻遏物 TetR和人類單純皰疹病毒 (HSV)的 VP16轉錄激活蛋白融合而成〔7〕,進一步修飾后能被四環素類及衍生物誘導并激活。應答質粒 pB I-EGFP,質粒上含有一個 Pbi-1的結構,該結構包含 Tet反應性元件 TRE(包含細菌四環素操縱子DNA序列 TetO)和人類巨噬細胞立早啟動子 PminCMV-1和 PminCMV-2,PminCMV-1啟動子后有多克隆位點,可以插入外源目的基因,PminCMV-2接有 EGFP綠色熒光蛋白基因〔8〕。當誘導因子 (四環素類衍生物)不存在時,tTA中 TetR成分和 TetO序列結合,通過 VP16發揮轉錄活性,啟動目的基因及熒光蛋白基因轉錄。加入誘導因子后,誘導因子與 tTA結合使其從 TRE上脫落,終止目的基因和熒光蛋白基因的轉錄。從而實現在外源誘導因子的作用下認為的控制目的基因的表達或關閉,并同時有綠色熒光蛋白作為報告基因〔9〕。

有資料表明〔10〕,鹽酸多西環素的半衰期比四環素長,即相同劑量的鹽酸多西環素與四環素相比能夠在體內存在更長的時間,發揮藥效的時間更長,因此本實驗中選取鹽酸多西環素作為誘導劑。

在本實驗中 Tet-off作為調控質粒,pB I-EGFP作為應答載體,選用鹽酸多西環素作為誘導劑。采用定向克隆將 PCR擴增的目的基因 HO-1片段插入到真核表達載體 pB I-EGFP中,將構建好的 pB I-EGFP-hHO-1質粒與調控質粒 Tet-off雙轉染進肝癌細胞 S MMC-7721中,48 h后檢測 HO-1在 mRNA和蛋白水平的表達情況。采用 RT-PCR方法檢測加入不同濃度的鹽酸多西環素后,重組質粒中 HO-1的表達,得到 Tet-off調控的 pB IEGFP-hHO-1的鹽酸多西環素誘導濃度為 2 000 ng/ml。載體構建成功,以及鹽酸多西環素對該 Tet-off調控系統誘導濃度的確定,為下一步實驗奠定了基礎。

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