遲緩愛德華氏菌膠體金快速檢測試紙的研制＊

辛志明

（1.福建省淡水水產研究所，福建福州350002；2.福建醫科大學福建省新藥安評中心，福建福州350108）

遲緩愛德華氏菌膠體金快速檢測試紙的研制＊

辛志明1，2

（1.福建省淡水水產研究所，福建福州350002；2.福建醫科大學福建省新藥安評中心，福建福州350108）

本研究用納米膠體金顆粒標記抗遲緩愛德華氏菌（AL60306NA1）單克隆抗體3A7并制備金標墊，將抗遲緩愛德華氏菌（AL60306NA1）單克隆抗體4F11與羊抗鼠抗體作為捕獲抗體包被硝酸纖維素膜，建立遲緩愛德華氏菌的膠體金免疫層析快速檢測方法。經過對試紙條的特異性和靈敏度測定，結果表明：試紙條與嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、海安氣單胞菌、產堿假單胞菌、無乳鏈球菌、大腸埃希桿菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌、創傷弧菌、副溶血弧菌、類志賀鄰單胞菌、魯氏不動桿菌等15種水產常見病原菌沒有交叉反應，與遲緩愛德華氏菌特異性反應，檢測靈敏度為1×105cfu·mL－1，檢測所需時間低于20 min。所制備的遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析檢測試紙條具有快速、簡便、特異性高和適應基層生產推廣應用等優點。

遲緩愛德華氏菌；單克隆抗體；膠體金；免疫層析

遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是牙鲆、大菱鲆、鰻鱺等多種水產養殖動物的致病菌［1－2］，導致了較嚴重的經濟損失。遲緩愛德華氏菌的檢測和鑒定方法主要有生理生化指標鑒定法［3］，分子生物學鑒定法［4－5］和間接EL1SA法［6］、熒光抗體技術［7］、斑點免疫金染色診斷方法（Dot—IGS）［8］等免疫學鑒定法。已建立的這些方法雖然各有優點，但均難以做到即時、快速、便捷，難以在基層養殖場推廣使用，因而，建立遲緩愛德華氏菌靈敏度高、特異強、檢測時間短、簡易的診斷和檢測技術對疾病的防控具有重要意義。

本文利用鰻鱺肝腎病的致病遲緩愛德華氏菌菌株（AL60306NA1）制備了單克隆抗體，將單克隆抗體應用于膠體金免疫層析快速檢測技術的研發，建立了遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析快速檢測試紙條的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、吸水紙（美國Millopre公司），氯金酸、牛血清白蛋白（Sigma公司），抗遲緩愛德華氏菌（AL60306NA1）單克隆抗體3A7、4F11（福建省淡水水產研究所水生動物病害控制研究室制備）［9］，兔抗鼠IgG抗體（武漢博士德生物技術有限公司），抗體純化試劑盒（PIERCE公司），XYZ3050膠體金三維噴點平臺（美國BioDot公司），ZQ4000膠體金切條機（上海金標公司），Himac CR22G高速離心機（日立公司），FDU－1200型冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司）。

1.1.2 菌株 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）（參考株、CQ－1）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）（哈維）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）（參考株）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）（參考株）由福建省農業科學研究院魚病研究中心提供。溫和氣單胞菌（A.sobria）（0068）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）（參考株）、海安氣單胞菌（Aeromonas haianesis）（10067）、類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）（LCCiL90625NA）由中國農業部漁業動植物病原庫提供。非O1群霍亂弧菌（Non－O1 Vibrio Cholerae）（96－2）、嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）（ML316）、創傷弧菌（Vibrio vulnificus）（NA1）、產堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）（參考株）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）（AB40511NA1）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）（TL60829NA）、魯氏不動桿菌（Acinetobacter lwoffii）（96－6）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）（AL60306NA1）、大腸埃希桿菌（Escherichia coli）（大腸埃希）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）（Jk7022NA1）由福建省淡水水產研究所水生動物病害控制研究室分離保存。

1.2 方法

1.2.1 細菌抗原制備 將1.1.2中提到的菌株經培養基增菌，3 000 r·min－1離心20 min后收集菌體，計數。0.4%甲醛滅活，3 000 r·min－1離心20 min，收集滅活菌體。

將收集的滅活遲緩愛德華氏菌（AL60306NA1）用小牛血清10倍稀釋，調整濃度為1×104～1×109cfu·mL－1作為陽性樣本用于測試試紙條的靈敏度。其它滅活菌株用小牛血清稀釋，調整菌體濃度為1×108cfu·mL－1，作為模擬陰性樣本用于測試試紙條的特異性。

1.2.2 抗遲緩愛德華氏菌3A7、4F11單克隆抗體的制備、效價測定、特異性分析 抗遲緩愛德華氏菌3A7、4F11單克隆腹水抗體的制備按常規方法進行；單克隆抗體效價測定、特異性分析采用ELISA法［10］。

1.2.3 抗遲緩愛德華氏菌3A7、4F11單克隆抗體的純化與純度鑒定 葡萄球菌蛋白A親和層析純化法和SDS－PAGE電泳法［10］。

1.2.4 膠體金的制備 膠體金制備、保存的器皿經過硅化處理。100 mL超純水加熱至沸騰，加入1%氯金酸1 mL，1%檸檬酸三鈉1 mL，保持沸騰快速攪拌，10 min后冷卻至室溫，掃描電鏡觀察顆粒均勻度及粒度［11］。

1.2.5 抗遲緩愛德華氏菌3A7、4F11單克隆抗體Western Blot分析 按常規方法進行，選取遲緩愛德華氏菌（AL60306NA1）、溫和氣單胞菌（0068）、豚鼠氣單胞菌（AB40511NA1）、嗜水氣單胞菌（參考株）、哈維氏弧菌（哈維）制備LPS，并進行SDS－PAGE與免疫印跡測試［12－13］。

1.2.6 最適標記p H值、蛋白量的確定 最適用標記p H值測定方法：用0.05 mol·L－1K2CO3和0.1 mol·L－1HCl分別將膠體金溶液調至不同p H梯度。取不同p H值的膠體金1.5 mL，分別加入抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體3A7 10μg迅速混勻，室溫放置30 min后，加入5%KCl 10μL，混勻后靜置4 h。不適合的p H值組溶液顏色由紅變藍甚至變黑、無色。觀察顏色變化較小的組為穩定組，該p H值為最適標記酸堿度。

最適標記蛋白量測定方法為：用0.05 mol·L－1K2CO3和0.1 mol·L－1HCl將膠體金溶液調至最適p H值后，向離心管內各加入最適p H值的膠體金溶液1.0 m L。將抗遲緩愛德華氏菌3A7單克隆抗體逐級稀釋后，各取10μL不同濃度的抗體順序加入上述試管中，快速充分混勻。4℃放置30 min，加入5%KCl 10μL，混勻后靜置4 h。觀察顏色變化較小的組，記錄加入的單克隆抗體蛋白濃度，該蛋白終濃度為最適標記濃度。

1.2.7 膠體金探針的標記 將抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體3A7離心去除沉淀蛋白，用0.2 mol·L－1K2CO3溶液調膠體金至最適p H值，加入抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體3A7至最適濃度，混勻標記；稀釋液重懸，離心棄上清；重復1次；稀釋液重懸沉淀，4℃貯存備用［14］。

1.2.8 硝酸纖維素膜的處理 將兔抗鼠二抗、抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體4F11用p H＝7.4的0.01 mol·L－1PBS（含1%tween－20）稀釋，12 000 r·min－1離心10 min去沉淀。設置膠體金三維噴點平臺參數，以2μL·cm－1蛋白量噴涂于硝酸纖維素膜的質控線與檢測線位置，37℃溫箱干燥2 h后封閉，37℃溫箱干燥4 h。

1.2.9 膠體金墊的制備 將金標抗體均勻噴涂于玻璃纖維膜上，37℃過夜干燥。

1.2.10 試紙條的組裝 將吸水紙、硝酸纖維素膜、膠體金墊、玻璃纖維從上到下依次固定于不干膠底板上，用膠體金試紙條切條機裁成0.35 cm寬度的試紙條，裝進塑料卡外殼，與干燥劑一起裝入鋁箔袋內，密封4℃貯存。

1.2.11 檢測與結果判讀 拆開試紙條密封袋，恢復至常溫，取100μL檢測樣本滴加在試紙條的加樣區內，水平放置，20 min內觀察結果，如試紙條硝酸纖維膜上僅質控線出現1條紫紅色帶為陰性；如出現2條紫紅色帶則結果判定為陽性；如質控線不出現紫紅色帶，無論檢測線是否出現，試紙條判定為失效。

1.2.12 試紙條的特異性、靈敏度檢測 拆開試紙條密封袋，恢復至常溫，取按1.2.1方法制備的模擬陽性、陰性樣本100μL滴加在試紙條的加樣區內，20 min內觀察檢測結果。

2 結果

2.1 抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體的純化鑒定

純化后的單克隆抗體3A7、4F11經SDS－PAGE電泳后顯示，純化后的抗體純度較高（見圖1），純化后的抗遲緩愛德華氏菌3A7單克隆抗體用于納米膠體顆粒的標記，抗遲緩愛德華氏菌4F11單克隆抗體用于檢測線捕獲抗體的噴涂。

圖1 抗體純化SDS－PAGE電泳分析Fig.1 SDS－PAGE analysis of Mc Ab purified with protein A

2.2 抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體3A7、4F11效價與特異性分析

抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體3A7、4F11與嗜水氣單胞菌（參考株、CQ－1、ML316）、哈維氏弧菌（哈維）、鰻弧菌（參考株）、溫和氣單胞菌（參考株、0068）、副溶血弧菌（參考株）、非O1群霍亂弧菌（96－2）、豚鼠氣單胞（AB40511NA1）、無乳鏈球菌（TL60829NA）、魯氏不動桿菌（96－6）、痢疾志賀氏菌（Jk7022NA1）無交叉反應，與遲緩愛德華氏菌（AL60306NA1）呈陽性反應。效價均為1.0×10－6。

圖2 抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體3A7、4F11 Western blot檢測Fig.2 Western blot analysis of Mc Ab 3A7 and 4F11

2.3 Western Blot結果分析

抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體3A7、4F11均經過親和層析純化得到的抗體，分別作為第一抗體對菌株的LPS抗原進行免疫印跡試驗。結果顯示單克隆抗體3A7、4F11均能對遲緩愛德華氏菌反應，免疫印跡有陽性結果，而對其他幾株菌的免疫印跡反應結果為陰性，說明抗遲緩愛德華氏菌單克隆抗體3A7、4F11均是針對遲緩愛德華氏菌LPS的單克隆抗體（見圖2）。

2.4 膠體金的制備

用電子顯微鏡觀察測定制備的納米膠體金，顆粒直徑為20 nm（見圖3）。

圖3 膠體金顆粒透射電子顯微鏡掃描圖Fig.3 Colloidal gold scanned by transmission electron microscopy

2.5 膠體金的最適標記條件

用0.1 mol·L－1的K2CO3和0.1 mol·L－1HCl調節膠體金溶液至p H＝8.2。將抗體加入膠體金溶液中使其終濃度為2.5μg·L－1，BSA終濃度為1%，混勻標記。最后保存于4℃2 mL p H＝7.4的0.01 mol·L－1PBS中（含2%BSA、0.5%PEG、12%蔗糖、1%Tween－20、0.02%NaN3），于4℃保存。

2.6 試紙條的特異性分析

將組裝后的試紙條與嗜水氣單胞菌（3株）、溫和氣單胞菌（2株）、豚鼠氣單胞菌（1株）、海安氣單胞菌（1株）、產堿假單胞菌（1株）、無乳鏈球菌（1株）、大腸埃希桿菌（1株）、哈維氏弧菌（1株）、鰻弧菌（1株）、創傷弧菌（1株）、副溶血弧菌（1株）、類志賀鄰單胞菌（1株）、痢疾志賀氏菌（1株）、非O1群霍亂弧菌（1株）、魯氏不動桿菌（1株）BSA樣本檢測結果均為陰性反應，與遲緩愛德華氏菌檢測結果為陽性反應（見表1，圖4），說明本試紙條對測試的菌株無交叉反應。

表1 試紙條檢測特異性試驗結果Table 1 The specificity test of the lateral－flow rapid strip

續表1

表2 試紙條檢測遲緩愛德華氏菌（AL60306NA1）靈敏度試驗結果Table 2 The sensitivity of strip to Edwardsiella tarda（AL60306NA1）

圖4 試紙條檢測特異性檢測Fig.4 Gold signals of specificity test in the lateral－flow rapid test

2.7 試紙條的靈敏度檢測

膠體金試紙條對模擬陽性樣本檢測的靈敏度為1×105cfu·m L－1（見表2，圖5）。

圖5 試紙條檢測靈敏度檢測Fig.5 Gold signals of sensitivity in the lateral－flow rapid test

3 討論

膠體金免疫層析檢測遲緩愛德華氏菌的快速檢測方法，是將膠體金標記與免疫學相結合發展起來的1種新技術。在水產動物病害診斷和病原檢測中，具有快速、簡便、特異性好、不需要輔助設備和檢測人員專業技術要求低等優點。本文報道的遲緩愛德華氏菌膠體金免疫層析快速檢測試紙條的檢測靈敏度為1×105cfu·m L－1，檢測時間為20 min。在檢測時間上較傳統的生理生化指標檢測、分子生物學方法鑒定及血清學ELISA檢測有不同程度的優越性；在檢測靈敏度和特異性上較基于多克隆抗體的ELISA方法有優勢。本方法具有快速、簡便、特異性高和適用于生產推廣應用的優點。

在靈敏度檢測中發現：當遲緩愛德華氏菌的菌體濃度在1×105～1×107cfu·m L－1之間時，試紙條上的檢測線呈良好的梯度顯色、質控線的顯色穩定；當菌體濃度為1×108cfu·m L－1時，檢測線條帶顏色極深、質控線條帶顯色減弱。分析原因可能是由于大量“抗體－抗原－金標抗體”捕獲結合導致了檢測線條帶呈強陽性顯色，而膠體金墊上的金標抗體大量被菌體競爭結合，使質控線可供結合的抗體量降低、導致質控線顯色減弱；當菌體濃度為1×109cfu·m L－1時，檢測線條帶顯色減弱，質控線條帶顯色微弱。分析原因可能是大量菌體與金標抗體競爭結合、游離金標抗體量減少，造成質控線條帶顯色微弱，同時，由于菌體與金標抗體競爭結合導致檢測線抗體捕獲的未結合金標抗體的菌體比例增加、單個菌體的金標抗體結合量減少等因素導致出現檢測線條帶的顯色較1×108cfu·m L－1淺，類似于ELISA檢測體系中的“HOOK”效應；同時，當檢測樣本中的菌體濃度小于1×104cfu·m L－1時，檢測結果為假陰性，所以對低菌液濃度的樣本應當增菌后再檢測，以彌補檢測限方面的不足。

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A Gold Immunochromatography Assay for the Detection of Edwardsiella tarda

XIN Zhi－Ming1，2
（1.The Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian Province，Fuzhou 350002，China；2.New Drug Safety Evaluation and Research，Fujian Medical University，Fuzhou 350108，China）

A rapid，accurate and easy gold immunochromatographic lateral flow assay system（GICA）was developed for detection of Edwardsiella tarda.The monoclonal antibody 3A7 against Edwardsiella tarda which was conjugated with colloidal gold acts as signal generator on conjugate pad.The monoclonal antibody 4F11 was used as a capture antibody at the test line（T），goat anti－mouse IgG antibody was used as the capture antibody at the control line（C）on the nitrocellose membrane.We assembled the GICA test trip with absorbing pad，conjugate pad，nitrocellose membrane which spray with capture antibody.The preliminary feasibility study of this method was described as following：The sensitivity of the GICA test strip towards Edwardsiella tarda was high with a detection limit of 1×105cfu·m L－1；The specificity of the assay showed no cross－reaction with other thirteen bacteria of aquaculture pathogens such as A.cavia，A.sobria，Streptococcus agalactiae，et al.；Accurate reading time for confirmation of the assay can be completed in 20 min with a liquid sample of 100μL.This study indicated that the GICA test strip provided high sensitivity and specificity for the detection of Edwardsiella tarda.

Edwardsiella tarda；coloidal gold；monoclonal antibody；gold immunochromatography assay

S965.9

A

1672－5174（2011）10－040－05

農業公益性行業科研專項（200803013）；閩發改高技項目（［2008］796）；閩財指項目（［2010］1031）資助

2010－06－03；

2011－04－27

辛志明（1983－），助理研究員，從事免疫學檢測技術研究。E－mail：xinzhiming2001＠yahoo.com.cn

責任編輯 王 莉