厚葉切氏海帶多糖的提取分離及其結構表征*

吳建東,于廣利**,李苗苗,趙 峽,王長云,劉 濤,顧晨曦

(中國海洋大學1.海洋藥物教育部重點實驗室;2.山東省糖科學與糖工程重點實驗室;3.生命學院,山東青島266003)

厚葉切氏海帶(Kjellmaniella crassifolia)屬于褐藻門、褐藻綱、海帶目、切氏海帶屬,是日本海域一種重要的褐藻資源。雖然國外學者對該類海藻水提取物的抗氧化活性[1]、免疫活性、褐藻膠M/G比[2-3]以及巖藻糖硫酸酯降解酶[4]等進行了相關研究,但沒有對其分離純化以及深入的理化性質研究。本文首次以該海藻為原料,采用不同的提取、分離方法,從中得到4種結構不同的多糖,并對其理化性質和結構特征進行比較和分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

厚葉切氏海帶(Kjellmaniella crassifolia),產地為日本。各種單糖標準品,標準牛血清白蛋白購于美國Sigma公司;葡聚糖系列分子量標準品(788,404,212,112,47.3,22.8,5.9 kD)購于日本Shodex公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PM P),購于美國Sigma-A ldrich公司;色譜級乙腈購于美國B&W公司;乙醇等其它試劑均為國產分析純。

高效凝膠色譜柱(PL aquagel-OH mixed,30 cm×7.5 mm,8μm,美國Perkin Elmer公司);XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5μm,美國Agilent公司);高效液相色譜儀(LC-20AD,日本島津公司);核磁共振波譜儀(JNM-ECP600,日本電子株式會社);紫外可見分光光度計(UV-2102 PCS,尤尼柯上海公司);冷凍干燥儀(ALPHA 1-4LD,德國CHRIST公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取分離[5]厚葉切氏海帶(40目)經甲醇和氯仿提取后40℃烘干備用。藻粉用15倍體積蒸餾水在80℃下攪拌提取3次(3 h/次),離心后合并上清液。上清液用稀鹽酸調節至p H=1,離心,收集沉淀和上清液。沉淀以適量NaOH溶解,透析后凍干得多糖KW1。上清液中和后加入適量CaCl2,離心收集上清液,經濃縮、透析、醇沉和干燥得粗多糖。該粗多糖經DEAE-Cellulose柱(XK16/20cm)純化后得到純品多糖KW2。殘余藻渣繼續用10倍體積2%Na2CO3于80℃提取3 h,重復3次,離心合并上清液,稀鹽酸中和后醇沉,經離心后分別收集沉淀和清液。沉淀經復溶后透析、濃縮和凍干,得多糖KA1;醇沉后上清液,經濃縮、透析、醇沉和干燥,得多糖KA2。

1.2.2 多糖醋酸纖維素膜電泳[6]采用王皓等報道的方法對多糖進行醋酸纖維素膜電泳分析,即以0.15 mol/L醋酸鋅(p H=6.3)為緩沖液,電流8 m A,電泳時間35 min。

1.2.3 相對分子量測定[7]采用HPGPC法,使用PL aquagel-OH mixed色譜柱測定多糖分子量;流動相為0.1 mol/L NaNO3水溶液,柱溫35℃,流速0.5 m L/min,示差檢測器。將各葡聚糖系列標準品及多糖樣品用流動相配成5 mg/m L水溶液,以標準葡聚糖分子量的對數(log M w)對色譜保留時間(tR)作圖,得標準曲線(log M w=14.84-0.648 tR;R2=0.996 8),計算樣品相對分子量。

1.2.4 多糖理化性質分析[5,8-10]用硫酸苯酚法以巖藻糖為標準品測定總糖含量;用硫酸鋇比濁法測定硫酸根含量;用硫酸咔唑法測定糖醛酸含量;用Folin-酚法測定粗蛋白含量。

1.2.5 單糖組成分析[5,11]將多糖進行全水解,經PM P衍生后采用高效液相色譜分析。色譜條件為:色譜柱:Agilent XDB-C18色譜柱;流動相:磷酸鹽緩沖液(p H=6.7)/CH3CN(83∶17,V/V);流速:1.0 m L/min;柱溫:25℃;進樣量:10μL;檢測器:DAD(245 nm)。

1.2.6 核磁共振氫譜(1H-NM R)分析 參照Grasdalen[12-14]的方法,將KW1與KA1用稀酸解聚(p H=3,80℃,1 h)后,經中和、透析和凍干,再經D2O交換3次,超導核磁共振波譜儀(ECP600 M Hz)于80℃測定。

2 結果與討論

2.1 多糖的提取

海藻經氯仿甲醇脫脂后40℃烘干,粉碎過40目篩備用。熱水提取時提取液粘度很大,氣味清香,KW1和KW2得率為13.4%和4.2%,而熱碳酸鈉水溶液提取多糖KA1和KA2得率分別為17.2%和1.2%。單糖組成分析表明,KW1和KA1為褐藻膠。KW2經DEA E-Cellulose弱陰離子交換柱0～2 mo l/L NaCl線性洗脫,在1.1 mol/L NaCl附近有單一峰,結果見圖1。

圖1 KW2在DEAE-Cellulose柱上的分離圖譜Fig.1 Separation graph of KW 2 on DEAE-Cellulose column

2.2 醋酸纖維素膜電泳分析

經醋酸纖維素膜電泳分析,KW2顯示單一條帶,其Rf值小于硫酸軟骨素A(CsA)、硫酸皮膚素(CsB)和硫酸軟骨素C(CsC),但與肝素(Hep)和乙酰肝素(HS)相似。KA2顯示為2條帶,其Rf值分別和CsA合CsB相近。由于采用醋酸鋅為緩沖液,KW1與KA1與鋅離子絡合形成沉淀,沒有發生泳動。由于選取的電泳條件適合硫酸多糖,可以以此推定KW2和KA2為硫酸多糖,也進一步驗證了KW1與KA1為不含硫酸根的褐藻膠。

圖2 4種多糖的醋酸纖維素膜電泳Fig.2 Cellulose acetatemembrane electrophoresis of four polysaccharides

2.3 多糖的基本理化性質分析

為了探討不同提取方法所得多糖的理化性質,本文分別測定了它們的總糖含量、硫酸基含量、糖醛酸含量和粗蛋白含量,并用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)測定了它們的相對分子量,結果見表1。從表中數據可知,KW2硫酸基含量高達30%,此外還含有5%糖醛酸以及少量蛋白,屬于一種硫酸酯化的多糖;KA2含有21%硫酸根,但其粗蛋白含量高達17%,這與采用堿提方法有關,需要采用其它方法進一步純化。

2.4 硫酸多糖的單糖組成分析

將KW2和KA2進行全水解后,采用PM P柱前衍生高效液相色譜法進行單糖組成測定。通過與10種單糖標準品比較確定其種類和含量。由于核磁共振氫譜可以精確地分析褐藻膠的結構,且褐藻膠樣品酸水解時對G和M的破壞率存在顯著差異,故不用高效液相色譜法分析2種褐藻膠樣品的單糖組成。

從表2可知,KW2的單糖組成相對簡單,以巖藻糖為主(82%),此外含有少量M an、GlcUA和Gal以及微量Glc和GlcN,是一種硫酸巖藻聚糖(Fucoidan),KW2與Sakai提取的SFGM單糖種類類似,但比例不同[4]。KA2與KW2單糖種類一致,但是比例顯著不同,和KW2相比,KA2中Fuc含量明顯減小,Gal含量顯著增大,且粗蛋白含量也較高。表明二者結構不同,KW2屬于Fucoidan,而KA2則屬于硫酸化巖藻半乳甘露雜聚糖(SFGM)。由于KW2和KA2是采用不同工藝獲得的2類結構不同的硫酸多糖,其生物活性的差別還有待于進一步研究。

表1 4種多糖的基本理化性質比較Table 1 Comparison of physicochemical p roperties of four polysaccharides

表2 2種硫酸多糖中單糖組成及其相對比例/%Table 2 Monosaccharide composition and ratio of KW2 and KA2

圖3 KW2的核磁共振氫譜圖Fig.3 1 H-NMR spectrum of KW2

2.5 KW 2的核磁共振氫譜(1 H-NM R)分析

1H-NM R譜可以初步分析巖藻聚糖硫酸酯的硫酸根位置以及巖藻糖化學環境[15]。KW2的巖藻糖異頭氫(5.38,5.28,5.26 ppm)比標準品[16]向低場偏移0.2～0.3 ppm,說明KW2的巖藻糖2位被硫酸根取代,而H4也大幅向低場偏移,說明其C4位也存在硫酸根取代。結合文獻[17],初步認為KW2的巖藻糖存在C2,4雙硫酸酯基取代。高場區巖藻糖甲基(1.0～2.0 ppm)的多重信號,表明巖藻糖的化學環境復雜。

2.6 KW 1與KA1核磁共振氫譜(1 H-NMR)分析

文獻表明,采用1H-NM R譜可以精確地表征褐藻膠的單糖組成、二糖組成(GG,GM,GM,MM)和三糖組成(GGG,GGM,M GM,M GG),進而反映出褐藻膠的嵌段分布,該細微結構的差別不僅影響其凝膠特性,也影響其生物活性。單體G的異頭氫質子G1的信號為5.01 ppm,單體G的第五位碳上的質子與G相連時,其化學位移為4.40 ppm(記為G5);當兩邊與G和M連接時,其化學位移為4.70 ppm(記為GGM),當兩邊均與M相鄰時,其化學位移為4.67 ppm(記為M GM)。單體M的異頭質子當與M相鄰時,其化學位移為4.62 ppm(記為MM),當與單體G相連時,其化學位移為4.65 ppm(記為M G)。根據該技術,可以將不同來源和不同提取工藝獲得的褐藻膠進行比較。參照Grasdalen[12-14]的方法,褐藻膠KW1與KA1的結構表征如圖4和表3。從圖4可知,KW1無G5峰,表明該組分沒有均聚G片段,而是以均聚M為主的褐藻膠,但是萱藻中的褐藻膠M SA(見圖4D)則是以均聚G為主。KA1和多肋藻褐藻膠ALG(見圖4E)結構類似。

圖4 不同來源褐藻膠1 H-NMR譜圖Fig.4 1 H-NM R spectra of alginates f rom different o rigin

表3數據顯示,熱水提取褐藻膠組分KW1中M/G高達6.14,而熱碳酸鈉水溶液提取得到的褐藻膠組分KA1中M/G只有1.90,表明它們在藻體細胞壁中處于不同狀態,后者G含量高,結合鈣鎂離子能力強,處于水不溶狀態,必須用熱碳酸鈉才能提取;前者M含量高,和金屬離子結合能力弱,采用熱水即可提取。該結果具有一定普遍性,本實驗室采用類似工藝分別從其它褐藻中提取得到了不同結構的褐藻膠[18-20],熱水提取的褐藻膠M含量較高,而熱碳酸鈉提取的褐藻膠G含量較高,這為從不同褐藻中提取結構不同的褐藻膠提供了參考。

表3 不同來源褐藻膠的細微結構比較Table 3 Fine structure comparison of alginates from different o rigin

3 結語

本文采用熱水和熱碳酸鈉工藝,從厚葉切氏海帶(Kjellm aniella crassifolia)中提取分離獲得了4種結構不同的多糖,并采用各種方法(如HPLC、HPGPC、電泳和核磁共振波譜等)分析了它們的結構特征。其中2種屬于含有不同巖藻糖含量的硫酸多糖,另外2種屬于含有不同甘露糖醛酸與古羅糖醛酸含量的褐藻膠。值得提出的是,水提取和碳酸鈉提取的褐藻膠以及褐藻糖膠的結構均顯著不同。這些資源豐富且結構特殊的多糖,為深入開展其構效關系研究提供了基礎。

[1] Kim B M,Jun J Y,Park YB.Antioxidative activity of methanolic extracts from seaweeds[J].J Korean Soc Food Sci Nutr,2006,35(8):1097-1101.

[2] Nishid E,Obraba N,Anazai H.Effects of extracting conditions on the properties of alginic acid from a brow n alga Kjellmaniella crassifolia[J].Bull Coll Agr&Vet Med,1992,49:133-136.

[3] Nishid E,Anazai H,Uchida N,et al.Extraction of alginic acid from a Brazillian brow n alga,Lam inaria brasiliensis[J].Hydrobiologia,1987,151/152(1):551-555.

[4] Sakai T,Kawai T,Kato I,et al.Isolation and characterization of a fucoidan-degrading marine bacterial strain and its fucoidanase[J].Mar Biotechnol,2004,6:335-346.

[5] Yu Guangli,Yang Bo,Zhao Xia,et al.A Comparative Analysis of Four Kinds of Polysaccharides Purified from Furcellaria lumbricalis[J].JOcean Univ China,2007,6(1):16-20.

[6] Wang Hao,Yu Guangli,Zhao Xia,et al.Two steps cellulose acetatemembrane electrophoresis analysis of oversulfated chondroitin sulfate in contaminated heparin[J].Chinese J Anal Chem,2009,37(8):1147-1151.

[7] 于廣利,胡艷南,楊波,等.海蘿藻多糖的提取分離及其結構表征[J].中國海洋大學學報:自然科學版,2009,39(5):925-929.

[8] 王培培,于廣利,楊波,等.選育羊棲菜與野生羊棲菜中褐藻膠與褐藻糖膠組成分析[J].中國海洋藥物,2009,28(3):39-43.

[9] 嵇國利,于廣利,吳建東,等.爆發期條滸苔多糖的提取分離及其理化性質研究[J].中國海洋藥物,2009,28(3):7-12.

[10] 張維杰.糖復合物生化研究技術[M].第2版.杭州:浙江大學出版社,1999:36.

[11] 付海寧,趙峽,于廣利,等.鹽藻多糖單糖組成分析的四種色譜方法比較[J].中國海洋藥物,2008,27(4):30-34.

[12] Grasdalen H A PM R.Study of the composition and sequence of urinate residues in alginates[J].Carbohydr Res,1979,68:23-31.

[13] Grasdalen H.13C-n.m.r.studies of monomeric composition and sequence in alginate[J].Carbohydr Res,1981,2:179-191.

[14] Grasdalen H.High-field 1H-n.m.r.spectroscopy of alginate:sequential structure and linkage conformations[J].Carbohydr Res,1983,118:244-260.

[15] Pomin V H,Valente A P,Pereira M S,et al.Mild acid hydrolysis of sulfated fucans:a selective 2-desulfation reaction and an alternative app roach for preparing tailored sulfated oligosaccharides[J].Glycobiology,2005,15(12):1376-1385.

[16] Ribeiro A,Vieera R,Mourao P,et al.A sulfated a-L-fucan from sea cucumber[J].Carbohydr Res,1994,255:225-240.

[17] Bilan,Grachev,Ustuzhanina,et al.A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L.[J].Carbohydr Res,2004,339:511-517.

[18] 吳建東,于廣利,王培培,等.高古羅糖醛酸含量萱藻(Scytosiphon lomentarius)多糖細微結構研究[J].海洋科學,2011,35(1):40-43.

[19] 王培培,于廣利,趙峽,等.海茸(Durvillaea Antarctica)多糖的分離純化與結構表征[J].中國海洋藥物,2010,29(5):1-5.

[20] 李苗苗,于廣利,吳建東,等.多肋藻(Costaria costata)多糖的提取分離及理化性質分析[J].中國海洋藥物,2011,30(1):1-5.