白云鄂博稀土礦區土壤中放線菌特征調查研究

樊永軍,閆 偉,王黎元,楊秀麗,鄭月霞

(1.包頭師范學院生物科學與技術學院,內蒙古包頭 014030;2.內蒙古農業大學林學院,內蒙古呼和浩特 010018;3.呼和浩特職業學院生物化學工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

極端微生物是生長在極端自然環境中微生物的總稱,包括嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜堿、嗜壓、抗輻射、極端厭氧等多種類型[1]。極端微生物適應環境的結果使其具有獨特的基因類型,從而也賦予其特殊的形態結構、生理機制及特殊的代謝產物,其存在的機理為更好地認知生命現象,發展生物技術提供了寶貴的知識源泉[2]。極端環境放線菌作為抗生素和酶制劑資源日益受到國內外學者的廣泛關注[3-7]。白云鄂博稀土礦作為中國最大的鐵-氟-稀土綜合礦床,含有豐富的鐵、螢石和稀土。稀土礦和鈮礦資源居全國之首,被譽為“世界稀土之鄉”[8]。但白云鄂博礦床原礦平均含天然放射性釷0.04%,含鈾0.001%,即礦石中的放射性核素釷顯著而鈾較低,釷的含量超過地殼平均含量近50倍,鈾的含量與巖石土壤相近,可以說是一座典型的伴生天然放射性釷礦床[9]。對該礦區耐高輻射放線菌的生物學特征及相關耐受性進行調查和研究,以期為下一步的深入研究、開發利用提供理論依據和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

白云鄂博稀土的東礦區和主礦區含釷較高,根據位置不同,于3月底在東礦區上、中、下3層分別設置3個樣點,每個樣點采3個土樣分別編號,在采樣點用滅菌鐵鏟除去表面植被和浮土,于地表4 cm以下取樣,將土樣置于滅菌封口袋或土樣盒中帶回實驗室[10]。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與形態觀察 采用傳統的稀釋平板涂布法對土壤樣品進行分離,37℃培養7～30 d。根據菌落大小、形態、顏色進行初步鑒定并純化,所得純培養物制成凍干牛奶管和斜面保藏于4℃備用。用淀粉瓊脂培養基(5%NaCl)于37℃條件下進行埋片培養,培養7、14、21、28 d,分別取出埋片,用光學顯微鏡Olympus BH-2觀察形態,并記錄拍照。

1.2.2 不同區域菌落相似性及多樣性分析 ①群落相似性的研究方法[11]:相似性指數是用來比較2個地域或2個測點的真菌區系。在生態學中最早Jaccard(1912)提出來的建立在有-無的基礎之上,是在2個地區都很常見的物種的數量與在2個地區都能發現的所有物種的數量的比值。常用公式:

式中c是2個地區共同存在的物種數量,a是僅在a地區發現的物種的數量,b是僅在b地區發現的物種的數量。Sorensen(Jacccard 1948):

它是對Jaccard改寫,這個方法適用范圍更廣,可應用于定量分析。式中c是2個樣品共同存在的物種數量,a和b分別是a地區(樣品)和b地區(樣品)中物種的數量。

②豐富度指數:豐富度指數(Species richness index)主要是測定一定空間范圍之內的物種數目以表達生物的豐富程度,本項研究選用2個豐富度指數[12]。

其中S為群落中物種的總數;N為觀察到的個體數(隨樣本的增大而增大)。

③放線菌菌落的多樣性分析:物種多樣性是一個區域或一個生態系統可測定的生物學特征,是生物多樣性在物種水平上的表現形式,因此一般用物種多樣性指標來分析生物多樣性[13]。常用的有物種的豐富度(Richess)、多樣性(Diversity)、均勻度(Evenness)等[14]。選用Shannom-W iener指數(H)和Simpson優勢度指數(D),討論根際土壤的細菌多樣性特征[15]。多樣性指數H計算公式:

均勻度指數(Evenness index)為群落中不同物種的多度(株數、生物量、蓋度或其它指標)分布的程度,即每個種個體數間的差異,也是群落多樣性研究中的一個十分重要的概念,其計算常用觀察多樣性和最高多樣性的比來表示,最高多樣性即所有種的多度相等時的多樣性[16]。據此導出了均勻度的計算公式:

Simpson均勻度

式中,N為所有物種的總個體數;ni是第i種的個體數。

1.2.3 耐受性試驗 ①鹽類耐受試驗:放線菌對鹽類有廣泛的適應性,本次實驗中只研究了鈉鹽和鉀鹽對放線菌的生長影響[17]。鹽的濃度分別配置成5%、15%、30%的NaCl,設3個重復,培養7～15 d,觀察并記錄;②酸、堿耐受試驗:利用HCl和NaOH分別調制培養基pH值為1、3、6、9、12,高壓滅菌后接種,培養24、48、72、96 h,觀察菌株的生長狀況并記錄;③溫度耐受性試驗[18]:對比菌株生長情況并記錄;④放射元素的耐受試驗:白云鄂博礦平均含天然放射性釷0.04%,超過地殼平均含量近50倍,是典型的天然放射性釷伴生礦[9]。為研究菌株對放射性元素的耐受性,在高氏一號培養基中加入放射源元素釷,根據釷元素在土壤中的含量,加入高于其1倍的含量,使釷元素的含量達到0.08%,觀察在含有大量放射性元素的培養基中菌株的生長狀態并記錄。

2 結果與分析

2.1 菌株的生長狀況觀察

從白云鄂博礦區采集來的土壤中共培養放線菌14株,觀察和記錄了14株放線菌的形態和特征(表1)。

2.2 不同區域菌落數量及所占比例

放線菌的種類百分含量=單菌落數量/總菌落數量×100%(表2)。從表2可以看出,放線菌菌落數量隨著采集位置的降低發生著明顯的變化,礦頂菌落數量占57.56%,而礦底所分離純化的菌落數僅為16.54%,而且在這些菌株中2號菌株占總菌落數的24.46%,為優勢菌株。

2.3 不同區域放線菌生態學特征分析

2.3.1 不同區域菌落相似性分析(表3) 同時運用ISJ和ISS 2個指數比較礦區不同位置土壤中放線菌群落的相似指數,相似指數越大說明2種情況下放線菌菌落的狀況越相近,反之相差越大,礦區位置不同,使礦區土壤中放線菌群落狀況發生了不同的變化。其中東礦頂部和東礦中部的相似性指數較大,說明它們的菌落狀況較相近,而東礦頂部和東礦下部以及東礦中部和東礦下部的相似性指數較小,說明菌落狀況發生了很大的變化,而且東礦中部和東礦下部的相似性指數較東礦邊緣和東礦下部大,群落狀況更為相近,而東礦中部和東礦下部的各種環境因素也較東礦邊緣和東礦下部相近,結果表明環境越相似微生物的相似性也越大,反映了環境對微生物的影響作用以及微生物對環境的適應性。

表1 放線菌生長狀況記錄Table 1 Record on growth status ofActinomycetes population

表2 不同區域菌落數量及所占比例Table 2 The quantity and percentage of Actinomycetes population in the different area

表3 不同區域菌落相似性分析Table 3 The analysis of Actinomycetes population similarity in the different area

2.3.2 不同區域菌落多樣性分析(表4) 從豐富度上看,隨礦區位置的降低土壤放線菌群落豐富度指數降低;從多樣性上看,礦區位置的降低也使得土壤放線菌群落多樣性指數降低。說明有可能礦區位置的降低抑制一些放線菌的生長。表現了環境對微生物的脅迫作用以及微生物對環境長期適應的結果。而均勻度指數卻隨礦區位置的降低反而增大,可能是實驗過程中采集土樣較少使得實驗數據不足最終導致計算均勻度不準確。

表4 不同區域菌落多樣性分析Table 4 The analysis of Actinomycetes population diversity in the different area

2.4 放線菌耐性分析

2.4.1 耐鹽性試驗(表5) 由表5可見,13株放線菌能耐受一定的NaCl濃度,12株放線菌能耐受一定的KCl濃度。大部分放線菌生長所需的Na+可被K+所替代,如2、7、8、9、11號,能同時適應高濃度(30%)的NaCl和KCl。但也有少數放線菌例外,如10、12號能在一定濃度的Na+下生長,在只有KCl的基礎培養基上卻不能生長,Na+不能被K+所代替,是專性嗜Na+的放線菌;6號菌株只在一定濃度的KCl條件下生長,卻不能在一定濃度的NaCl條件下生長,這說明了放線菌對不同類型陽離子的適應也是有一定選擇性的。

表5 不同鹽類濃度環境下放線菌的生長狀況Table 5 The growth status ofActinomycetes population under the different salt concentration environment

2.4.2 耐酸、堿性試驗 放線菌的酸堿耐受實驗普遍表現為對堿的耐受性,具體表現為放線菌在pH值為1、3的酸性條件下培養時1～14號菌株均無生長,但在相對pH值為9的堿性環境下1～14號菌株都能夠正常生長,而在pH值為12的高堿性環境下大部分可以生長,其中2號菌株正常生長,12號菌株可較慢生長。一般情況下,放線菌的最適生長pH值范圍為5.6～6.0,但在白云鄂博礦區檢測到的放線菌最適生長pH值范圍有所改變,對pH值的適應范圍值增廣且表現為對堿的適應的增廣。這反映了微生物對環境的長期適應性以及環境對微生物的脅迫作用。

表6 不同pH條件下放線菌的生長狀況Table 6 The growth status ofActinomycetes population under the different pH values environment

2.4.3 耐低溫或高溫試驗 試驗結果與參考文獻[18]中所得結果基本相同。

2.4.4 耐高輻射元素試驗(表7)

表7 高輻射元素環境下放線菌的生長狀況Table 7 The growth status ofActinomycetes population under the different high rational factor environment

試驗結果表明1～14號菌株在加入礦區位置2倍含量的釷元素的培養基中生長情況,相對對照組而言,都有所減弱或完全不生長,這說明微生物對輻射環境只表現一定的抗性而不是嗜好。

3 討 論

采用稀釋平板培養法從稀土高輻射極端環境中分離得到14株放線菌,并進行了簡單的菌落形態特征描述,從這一結果中可以看出,從稀土高輻射區域分離得到的可培養的放線菌的種類和數量要比從一般土壤中得到的放線菌要少的多,目前對于極端環境放線菌的分離方法,一般較為常用的仍為稀釋平板法。但是由于其難培養性,極端環境中放線菌種類的特殊性,導致對于極端環境放線菌的分離與利用的瓶頸作用,因此改良分離方法,對獲取和利用極端環境放線菌有著非常重要的意義。

應用相似性指數、豐富度指數、多樣性指數及均勻度指數對所選14株放線菌進行分析后發現,白云鄂博東礦區不同區域放線菌的生態分布總的來說隨著開礦深度和高輻射元素的分布呈規律性分布,這也從側面反映了微生物對環境的長期適應性以及環境對微生物的脅迫作用。

在耐受性實驗中14株放線菌都有不同程度的耐受性,其中2、7、9、11號菌株同時可以在高濃度(30%)的Na+和K+培養基中生長,二者可互相代替,且菌株無專性嗜好,但6號菌株只能在K+培養基中緩慢生長,說明其不耐高鹽環境且對鹽具一定選擇性;通過耐酸堿性實驗發現,白云鄂博礦區極端環境中所選放線菌都不耐強酸,但可耐強堿,尤其2號菌株可在pH為12的環境中正常生長。一般情況下,放線菌的最適生長的pH值范圍為5.6～6.0,但在白云鄂博礦區檢測到的放線菌最適生長pH值范圍有所改變,對pH值的適應范圍值增廣且表現為對堿的適應的增廣。而耐受高輻射元素試驗中一些放線菌菌株都有不同程度的生長減弱,僅有4號和6號菌株不能正常生長,這也從一定程度上說明所選放線菌對高輻射元素僅是耐受,并不是完全的嗜好,同時,由于實驗數據梯度設計偏少,也不能完全說明問題。本研究中耐低溫或高溫實驗,與李琇等得出同樣結論[19],可見在分離極端環境中的微生物時,考慮微生物原有的生境,模仿其生境調整培養基成分及實驗條件有利于微生物的分離。

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