紅曲多糖液態(tài)發(fā)酵條件與抗氧化活性的研究

汪鵬榮,陳攀攀,藍(lán)麗精,蔣冬花,林遙雪

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的由10個(gè)以上的單糖以糖苷鍵連接而成的不溶于高濃度乙醇、正丁醇及丙酮等有機(jī)溶劑的高分子多聚物,與動(dòng)、植物多糖不同,真菌多糖分子單體之間主要以β-1,3與β-1,6糖苷鍵結(jié)合,形成鏈狀分子,具有螺旋狀的立體構(gòu)型[1]。自1970年日本千原羽田從香菇中分離出一種抗腫瘤的多糖后,科學(xué)界掀起了食用真菌多糖研究的熱潮。真菌多糖在國(guó)際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物”(biological response modifier,簡(jiǎn)稱BRM),具有很大的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。大量的藥理實(shí)驗(yàn)表明,真菌多糖具有還原能力,可以消除體內(nèi)的自由基,具有抗氧化性,因而具有刺激免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性,己經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域[2]。目前,已在國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用的真菌多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、靈芝肽多糖、猴頭菌多糖、銀耳多糖等[3]。紅曲霉是一類十分重要的藥用真菌,紅曲霉發(fā)酵制成的中藥紅曲具有活血化瘀、健脾消食等功效及降脂、降壓、降糖和抗腫瘤等作用[4],在食品、色素、中藥等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用,隨之紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物也成為研究焦點(diǎn)[5]。多糖類物質(zhì)是紅曲霉所含有的重要化學(xué)成分之一,相關(guān)研究表明紅曲多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等多種功能[6-8]。紅曲多糖可像靈芝多糖一樣通過液態(tài)發(fā)酵而實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),但目前國(guó)內(nèi)對(duì)紅曲多糖的發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究不多,相關(guān)報(bào)道的胞外多糖產(chǎn)量普遍較低,尚處于探索階段。通過從不同環(huán)境中采集來的紅曲米中分離篩選出1株高產(chǎn)胞外多糖紅曲霉菌株Mr-70,對(duì)其培養(yǎng)基組分及液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)一步對(duì)胞外粗多糖清除DPPH自由基的能力進(jìn)行了研究,以期為紅曲多糖的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 紅曲霉菌株Mr-70分離自浙江金華地區(qū)采集來的紅曲米。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL,pH自然(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g);②種子培養(yǎng)基[9]:葡萄糖50 g,蛋白胨5 g,酵母膏1 g,KH2PO41 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,水1 000 mL,pH 6.0;③發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50,蛋白胨20,KH2PO4·3H2O 8,MgSO40.5,pH 6.0。

1.1.3 試劑 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)、甲醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、番薯粉、乳糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、無水乙醇,均為國(guó)產(chǎn)分析純;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 LRH-280生化培養(yǎng)箱,廣東醫(yī)療器械廠;C24KC生物恒溫?fù)u床,CERTIFIED;M IKRO-22R高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Hettichi公司;UV-7504紫外可見分光光度計(jì),上海欣茂儀器公司;DHG-9101.28A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,山東鄄城科源儀器設(shè)備廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,山東鄄城科源儀器設(shè)備廠;JA3003A天平,上海精天電子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將保存的紅曲霉菌株Mr-70用接種針接入斜面培養(yǎng)基,30℃恒溫培養(yǎng)5 d。

1.2.2 種子液制備 用打孔器(直徑0.8 cm)取30℃培養(yǎng)5 d的平板菌種5塊分別接種到種子培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝入50 mL液體培養(yǎng)基),30℃,于200 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)48 h的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為8%,250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)液,180 r/min、30℃培養(yǎng)96 h,最后取發(fā)酵液分析檢測(cè)粗多糖的產(chǎn)量。

1.2.4 發(fā)酵液中多糖含量的測(cè)定[10-11]發(fā)酵濾液定容至100 mL,取適量發(fā)酵液,5 000 r/min離心30 min,將所獲上清液抽濾,除去其中的不溶物,取上清液15 mL加入60 mL無水乙醇中,在5℃下靜置8 h過濾,沉淀在80℃烘干12 h至恒重,稱量即為胞外粗多糖含量。

1.2.5 胞外粗多糖清除DPPH的測(cè)定方法[12-13]DPPH·是一種在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定的自由基,呈紫色,不溶于水,可溶于甲醇溶液,在517 nm處有一個(gè)特征吸收峰,當(dāng)其遇到自由基清除劑時(shí),與DPPH的孤電子配對(duì),使其顏色變淺,在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度變小。配制不同濃度的粗多糖溶液,離心取2 mL上清于試管中,再加入2 mL DPPH的甲醇溶液(DPPH濃度為1×10-4mol/L),混合均勻,0.5 h后用分光光度計(jì)在517.4nm處測(cè)定其吸光度Ai;同時(shí)測(cè)2 mL DPPH溶液+2 mL甲醇混合后的吸光度A0和2 mL提取液+2 mL甲醇混合后的吸光度Aj,實(shí)驗(yàn)中每個(gè)濃度平行做3次,取其平均值。按下式計(jì)算對(duì)自由基的清除率:

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、番薯粉、乳糖為碳源進(jìn)行試驗(yàn)(碳源質(zhì)量濃度設(shè)定為50 g/L),將紅曲霉菌Mr-70接入上述各發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃條件下,以200 r/min的速度搖瓶培養(yǎng)96 h,對(duì)發(fā)酵液中的多糖含量和菌體生物量進(jìn)行初測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表1),紅曲霉菌Mr-70利用以上6種物質(zhì)產(chǎn)胞外多糖的能力依次是葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>乳糖>番薯粉>淀粉,其中以葡萄糖為唯一碳源時(shí)的胞外多糖產(chǎn)量最高達(dá)5.63 g/L,而從菌絲體產(chǎn)量來看葡萄糖和麥芽糖是最適合紅曲霉生長(zhǎng)的碳源,因此確定葡萄糖為最適碳源。

表1 不同碳源對(duì)M r-70發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖能力的影響Table 1 The effects of carbon sources on the MEP yield of Mr-70

2.2 氮源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別采用蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、尿素為氮源進(jìn)行試驗(yàn)(氮源質(zhì)量濃度設(shè)定為20 g/L),將紅曲霉菌Mr-70接入上述各發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h,對(duì)發(fā)酵液中的多糖含量和菌體生物量進(jìn)行初測(cè)。由表2顯示有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更有利于紅曲霉菌Mr-70的生長(zhǎng),其中蛋白胨和酵母膏對(duì)菌絲體生長(zhǎng)最有利,但是蛋白胨是最佳產(chǎn)胞外多糖所需的氮源,因此,選擇蛋白胨作為紅曲霉菌Mr-70的最適氮源。

表2 不同氮源對(duì)M r-70發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖能力的影響Table 2 The effects of nitrogen sources on theMEP yield ofMr-70

2.3 碳氮比對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在上述碳氮源實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,分別選取碳氮比(質(zhì)量比)1◇1、2◇1、3◇1、4◇1、5◇1、6◇1進(jìn)行碳氮比篩選實(shí)驗(yàn)。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類碳氮比不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h,對(duì)發(fā)酵液中的多糖含量進(jìn)行初測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。由圖1可知,紅曲霉菌Mr-70菌絲體的產(chǎn)量隨碳氮比的增加而增加;胞外多糖產(chǎn)量先隨著碳氮比的增加而增加,當(dāng)碳氮比為3◇1時(shí)達(dá)到最大值8.40 g/L,然后隨著碳氮比的增加多糖產(chǎn)量反而下降。過高的碳氮比只適合菌體的生長(zhǎng)卻不利于菌體分泌胞外多糖,過低則會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和胞外多糖的分泌,因此紅曲霉菌Mr-70最適產(chǎn)胞外多糖的碳氮比初步確定為3◇1。

圖1 不同碳氮比對(duì)紅曲霉菌M r-70菌絲體生長(zhǎng)和產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.1 The effects of ratio ofm(C):m(N)on theMEP yield ofMr-70

2.4 無機(jī)鹽濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

以上述最適碳氮比為基礎(chǔ)配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基,分別選取不同濃度的無機(jī)鹽添加量:KH2PO4·3H2O(2、4、6、8、10、12 g/L)、MgSO4(0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 g/L)進(jìn)行最適無機(jī)鹽濃度篩選實(shí)驗(yàn)。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類無機(jī)鹽濃度不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h,對(duì)發(fā)酵液中的多糖含量進(jìn)行初測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。無機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)代謝產(chǎn)物必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基中無機(jī)離子種類與濃度對(duì)微生物胞外多糖的合成有重要影響,并同時(shí)影響胞外多糖的化學(xué)組成和物性[14]。其中P、S、K、Mg 4種礦質(zhì)元素必須通過外界添加才可達(dá)到菌體生長(zhǎng)所需濃度,對(duì)于這幾種元素來源,首選KH2PO4·3H2O和MgSO4,可以同時(shí)提供這4種元素[15],因此有必要通過實(shí)驗(yàn)確定KH2PO4·3H2O和Mg-SO4的最適添加量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知,無機(jī)鹽濃度對(duì)紅曲霉菌絲體生長(zhǎng)的影響不太明顯,但對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響卻很明顯,當(dāng)Mg-SO4和KH2PO4·3H2O濃度分別為1.1 g/L(圖2a)、10 g/L(圖2b)時(shí)多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值8.56 g/L。

圖2 無機(jī)鹽添加量對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 The effects of concentrations of KH2PO4·3H2O andMgSO4on theMEP yield ofMr-70

2.5 培養(yǎng)基起始pH對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

圖3 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 The effects of initial pH on theMEP yield ofMr-70

將菌種接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,以3.5為初始pH,0.5一個(gè)梯度,逐漸增加至7.0,通過對(duì)不同初始pH值的測(cè)試,獲取最佳初始pH。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類起始pH不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h,對(duì)發(fā)酵液中的多糖含量進(jìn)行初測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。多糖的合成在多種酶的共同催化作用下完成,pH可影響培養(yǎng)基中有效成分的溶解性及運(yùn)輸、相關(guān)酶活性、副產(chǎn)物的形成及發(fā)酵過程中的氧化還原反應(yīng),從而影響微生物的生長(zhǎng)與代謝[16]。由圖3可知,酸性環(huán)境更有利于菌絲體生長(zhǎng),卻不利于胞外多糖的產(chǎn)生,當(dāng)pH為6.5時(shí)紅曲霉Mr-70胞外粗多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值8.7 g/L。

2.6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

將紅曲霉菌Mr-70接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,以最佳pH值為條件。選取0、50、100、150、200、250 r/min 6個(gè)轉(zhuǎn)速梯度,測(cè)試Mr-70產(chǎn)胞外多糖的最佳搖床轉(zhuǎn)速。大多數(shù)產(chǎn)胞外多糖的微生物需氧才能合成胞外多糖,故發(fā)酵過程中通氣極為重要,過高或者過低都不利于菌絲體生長(zhǎng),進(jìn)而影響胞外多糖產(chǎn)量。紅曲霉是一種好氧真菌,本實(shí)驗(yàn)通過改變轉(zhuǎn)速來改變搖瓶通氣量,由圖4可知,紅曲霉菌絲體的生長(zhǎng)隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而增加,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min時(shí)菌絲體量達(dá)到最大值21.04 g/L;搖床轉(zhuǎn)速在50～200 r/min時(shí),多糖產(chǎn)量隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而增加,但是過高的氧氣含量卻不利于胞外多糖的產(chǎn)生,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min胞外粗多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值9.33 g/L。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 The effects of rotation speeds on theMEP yield ofMr-70

2.7 搖瓶溫度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

將紅曲霉菌Mr-70接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,以最優(yōu)pH和最優(yōu)搖床轉(zhuǎn)速為條件,測(cè)試從20～40℃下不同的胞外多糖產(chǎn)量,以確定最佳搖瓶溫度。微生物的生命活動(dòng)都是由一系列生物化學(xué)反應(yīng)組成的,這些反應(yīng)都要在各種酶的催化下進(jìn)行,而溫度是保證酶活性的重要因素,因此,在發(fā)酵過程中保證穩(wěn)定合適的溫度具有重要意義[17]。溫度可以影響微生物體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行,進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)和各種代謝產(chǎn)物的積累,因此每種微生物都有其最適的生長(zhǎng)溫度和最適的產(chǎn)胞外多糖溫度。由圖5可知,當(dāng)搖瓶溫度在20～36℃之間時(shí),菌絲體的產(chǎn)量隨著溫度的增加而增加,當(dāng)溫度高于36℃時(shí)菌絲體產(chǎn)量開始緩慢下降;而胞外多糖產(chǎn)量在溫度為32℃時(shí)達(dá)到最大值10.15 g/L,因此紅曲霉菌Mr-70的最適生長(zhǎng)溫度(36℃)與其最適產(chǎn)胞外多糖溫度(32℃)不完全一致。

圖5 搖瓶溫度(℃)對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 The effects of temperature on the MEP yield of Mr-70

2.8 粗多糖的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

圖6 不同濃度的胞外粗多糖對(duì)DPPH·的清除作用Fig.6 The scavenging effect ofMEP on DPPH·

DPPH·分析法被廣泛用于清除自由基物質(zhì)活性的研究,可評(píng)價(jià)有機(jī)清除劑的活性[18]。不同濃度的胞外粗多糖的DPPH·清除能力見圖6。由圖6可知,當(dāng)粗多糖濃度在0.5～2 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH·的清除能力呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì);當(dāng)粗多糖濃度超過2 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH·的清除能力增加緩慢。Tseng等[19]從靈芝中提取的多糖,在濃度為5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH·清除率為36.4%～58.4%;葉明等[20]從黑芝胞外提取的多糖,在濃度為40 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH·清除率為23.4%,而5 mg/mL的紅曲霉胞外粗多糖的DPPH·清除率就達(dá)82.24%,因此,紅曲霉胞外粗多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH·清除能力。

3 結(jié) 論

通過對(duì)紅曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)條件進(jìn)行研究,初步得出紅曲霉菌Mr-70產(chǎn)胞外多糖的最適培養(yǎng)條件:葡萄糖60 g/L,蛋白胨20 g/L,K2HPO410 g/L,MgSO4·7H2O 1.1 g/L,發(fā)酵液起始pH 6.5,32℃、200 r/min搖床培養(yǎng)96 h,紅曲霉菌株Mr-70的胞外粗多糖產(chǎn)量可達(dá)10.15 g/L。

二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,若樣品能清除它,則提示樣品具有降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用[21]。紅曲霉胞外粗多糖對(duì)DPPH·具有較強(qiáng)的清除能力,表明紅曲霉胞外粗多糖具有良好的體外抗氧化活性,而且紅曲霉胞外粗多糖是一種天然提取物,具有成本低廉、安全無毒等特點(diǎn),因此,紅曲霉胞外粗多糖作為天然抗氧化劑具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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