肌動蛋白結合脂筏促進巨噬細胞攝入土拉弗朗西斯菌

潘 欣,曾思良,蔡家麟,吳鑒今,楊 光,黃通來

(第二軍醫大學微生物學教研室,上海 200433)

土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)最早于1911年在美國加利福尼亞的圖萊里縣(Tulare County)暴發的鼠疫樣疾病的地松鼠(ground squirrel)中分離出來[1]。20世紀30年代和40年代由于大規模的水路運輸,該病在歐洲、前蘇聯和美國流行,因該病最常見于野兔中,也稱野兔熱(rabbit fever)[2]。土拉弗朗西斯菌包括4個確認的亞種:土拉熱(tularensis)亞種(A型)、全北區(holarctica)亞種(B型)、中亞細亞(mediasiatica)亞種和新兇手(novicida)亞種。其他從環境中檢測到的亞種尚未成功分離培養。A型菌株(高致病性)幾乎專屬于北美,而B型分布在整個北半球溫帶地區,相對弱毒,未治療的皮膚感染死亡率低于0.5%[3]。我國自1957年首次在內蒙通遼地區從黃鼠體內首次分出土拉弗朗西斯菌后,在黑龍江、青海、西藏、新疆等地又從人、野兔、硬蜱中相繼分離出該菌。西藏阿里地區已證實為土拉弗朗西斯菌病的自然疫源地[4]。土拉弗朗西斯菌為革蘭陰性、不運動、不形成芽胞的需氧球桿菌,該菌采取有效的方式侵入宿主細胞并在細胞內增殖,在侵入以及在宿主細胞內運輸內化期間,曾觀察到巨噬細胞膜微結構域中的窖蛋白涉及土拉弗朗西斯菌的早期入侵[5]。最近的研究發現土拉弗朗西斯菌感染巨噬細胞15～30 min,可查見脂筏相關成分如膽固醇和神經節苷脂G M1涉及土拉弗朗西斯菌侵入胞內,肌動蛋白與膽固醇結合為巨噬細胞攝入細菌提供動力;感染60 min以后,脂筏難以查見,但可觀察到肌動蛋白富集在細菌周圍,可能與細菌在胞內運動或胞間感染有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞系和質粒 土拉弗朗西斯菌全北區亞種LVS(Francisella tularensissubsp.holarctica LVS,以下簡稱FTLVS)及表達綠色熒光蛋白的FTLVS-GFP菌株為本室保存[5]。表達6-磷酸甘露糖受體的J774A.1細胞購于ATCC。

1.1.2 培養條件 細菌用含有IsoVitaleX(BD Biosciences)的巧克力Ⅱ瓊脂平板于37℃培養72 h[6]。完全細胞培養基為DMEM(Sigma)中補充了10%胎牛血清(HyClone,未進行熱滅活)。活菌操作在生物安全三級實驗室完成[7]。

1.2 方法

1.2.1 土拉弗朗西斯菌LVS感染巨噬細胞 用一次性接種環挑取數個土拉弗朗西斯菌LVS克隆懸浮于含10%FBS的DMEM中。5 000 r/min離心10 min。細菌沉淀用含10%FBS的DMEM洗2次,再重懸于含10%FBS的DMEM中。用OD600/克隆形成單位標準曲線將感染復數調整為50。J774A.1細胞接種于細胞培養皿中培養18 h。細胞用暖的完全細胞培養基洗2次。在細胞單層中加入MO I為50的用相應培養基懸浮的細菌,1 000 r/min室溫離心5 min,然后37℃下在5%CO2中放置60 min,用暖的完全細胞培養基洗滌3次,換含10μg/mL慶大霉素的完全細胞培養基作用30 min,暖的完全細胞培養基洗2次,換不含慶大霉素的完全細胞培養基,37℃下在5%CO2中培養至指定時間點。

1.2.2 免疫熒光染色 J774A.1接種于培養皿的無菌蓋玻片上,細胞感染MO I為50的FTLVSGFP,在給定時間內用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗,用含0.5%Triton X-100的PBS透化30 min,PBS洗,用 Image-iT FX信號增強劑(Invitrogen)封閉30 min,成為固定片。用PBS將霍亂毒素B亞基(cholera toxin B,CTB)(Invitrogen)稀釋至1μg/mL,于4℃與固定片孵育10 min,PBS洗。CTB能與脂筏中的神經節苷脂G M1特異結合,觸發胞膜窖介導(caveolae-mediated)的毒素內化[8]。用PBS將鍵合了Alexa 594的兔抗霍亂毒素B亞基IgG(Invitrogen)按1◇200稀釋,室溫顯色15 min。PBS洗后,過一遍雙蒸水,晾干。蓋玻片用抗褪色金牌介質(Invitrogen)在載玻片上裝片。J774A.1接種于培養皿的無菌蓋玻片上,細胞感染MO I為50的FTLVS-GFP,培養皿中同時加入終濃度為5μg/mL菲律平Ⅲ(filipin III)(Sigma)。菲律平Ⅲ是一種結合膽固醇的制劑,插入細胞膜后顯示藍色熒光[9]。感染60 min后制成固定片。鍵合了Alexa 594的鬼筆環肽(phalloidin)(Invitrogen)按1◇500稀釋,于室溫與固定片孵育20 min。鍵合了Alexa 594的鬼筆環肽可與細胞肌動蛋白結合顯示紅色熒光。PBS洗后,過一遍雙蒸水,晾干,裝片。帶有電動Z-軸的Olympus IX81熒光顯微鏡置于隔離器中[10],每個熒光通道在Z軸取40疊。使用DAPI、FITC和德克薩斯紅濾光片。用Volocity 4.1( Improvision)軟件融合熒光通道。數據通過生物安全三級實驗室內網傳出。

2 結果與分析

2.1 脂筏結合肌動蛋白參與FTLVS的早期入侵

脂筏是膜脂質雙層內富含鞘磷脂、鞘糖脂、膽固醇、GPI-錨固蛋白和Src-kinase等的微區[11]。神經節苷酯G M1屬于含唾液酸的鞘糖脂,鞘脂使脂筏具有不溶于非離子型去垢劑的特點。霍亂毒素B亞基(cholera toxin B,CTB)用于標記脂筏中的神經節苷酯G M1。圖1顯示FTLVS-GFP感染J774A.1細胞15 min可與神經節苷酯G M1共定位。菲律平Ⅲ是一種結合膽固醇的制劑,插入細胞膜后顯示藍色熒光,5μg/mL可用于標記參與脂筏形成的膽固醇成分。圖2顯示FTLVS-GFP感染J774A.1細胞15 min可與膽固醇共定位,機動蛋白與膽固醇結合,有助于脂筏成分的運動。感染60 min后,與菲律平Ⅲ或神經節苷脂G M1共定位的FTLVS-GFP難以見到,脂筏逐漸消失。細菌在胞內運動比較自如,圖3顯示FTLVS-GFP感染J774A.1細胞60 min周圍富集細胞肌動蛋白,可能與細菌在胞內運動或胞間感染有關。

圖1 脂筏參與捕獲土拉弗朗西斯菌Fig.1 Lipid raftswere concerned with the engulfing ofFrancisella tularensisin macrophages

圖2 巨噬細胞的膽固醇參與攝取土拉弗朗西斯菌Fig.2 Cholesterolwas concerned with the uptake ofFrancisella tularensisin macrophages.

圖3 肌動蛋白參與土拉弗朗西斯菌胞內運動Fig.3 Actinswere concerned with the moving ofFrancisella tularensisin macrophages

3 討 論

巨噬細胞是機體免疫系統的重要細胞成分,在非特異性免疫防御及特異性免疫應答中均起十分關鍵的作用。巨噬細胞通過其表面受體如甘露糖受體、清道夫受體、Toll樣受體等模式識別受體(pattem recognition receptor,PRR)識別微生物表面的病原相關的分子模式(pathogen-associated molecular pattem,PAMP),如細菌的脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、脂磷壁酸、未甲基化的CpG DNA、分枝桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖、酵母菌的甘露聚糖等[12];另外,巨噬細胞還能通過其表面的補體受體、FcγR(即IgG Fc受體,有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種類型)調理吞噬病原體。

土拉弗朗西斯菌是一種選擇了多種優化方式有效地侵入宿主細胞并在細胞內增殖的病原體。目前已報道的與土拉弗朗西斯菌攝入相關的PRR類受體主要有甘露糖受體[13]、A類清道夫受體[14],還有補體C3[15]和補體受體CR3[16]。另外,土拉弗朗西斯菌具有PAMP效應的延長因子Tu(elongation factor Tu,EF-Tu)可與巨噬細胞表面的核仁素(nucleolin)結合而被細胞攝入[17]。前期研究也顯示巨噬細胞表面的轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1)[18]、質膜微區結構域中的窖蛋白-1(caveolin 1)[5]均參與了攝取土拉弗朗西斯菌。

質膜微區結構域包括瓶狀反折的小窩(含有窖蛋白)和脂筏(缺少窖蛋白)[19]。脂筏大小為55～300 nm,富含膽固醇、鞘磷脂,可結合多種蛋白質,為多種信號轉導途徑的對話提供一個平臺[20];脂筏還可以承載多種與PRR相關的協同受體調節PAMP-PRR信號[21]。

本研究免疫熒光結果顯示,巨噬細胞膜微結構域中的脂筏參與了FTLVS的早期入侵。研究中采用了感染的同時用菲律平Ⅲ快速沖擊細胞,從而可以查見細菌周圍包繞富含膽固醇的結構域(圖2C),胞內的肌動蛋白可與膽固醇結合,促進脂筏運載細菌進入巨噬細胞。由于菲律平Ⅲ長時間處理細胞會干擾細胞膜微結構域,本研究也使用了霍亂毒素B亞基以標記脂筏。圖1C顯示霍亂毒素B亞基所標記的脂筏中的神經節苷酯G M1可與細菌結合,觸發細菌的內化。當細菌離開細胞膜后,脂筏消失(圖3B)。隨著感染時間的推移,土拉弗朗西斯菌所在囊泡可與肌動蛋白結合(圖3C),在胞內運動或引發胞間感染。

由于脂筏可以攜帶多種信號轉導元件,可以進一步研究土拉弗朗西斯菌與脂筏相關的致病或免疫信號通路;由于土拉弗朗西斯菌可以離開脂筏,推測其可能產生了脂筏的降解物質,也值得進一步研究。

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