草酸青霉液體發酵產果膠酶條件的優化及其產物的酶學性質

藍麗精,蔡琪敏,宋迤明,董夏夢,蔣冬花

(浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004)

果膠酶是分解果膠質的多種酶的總稱,最初是在桔子中提取出來的[1]。其主要來源于動植物及微生物,尤其是微生物,因具有生長速度快、生長條件簡單、代謝過程特殊等特征,成為果膠酶的重要來源[2],在食品工業、紡織工業、環境保護等方面都有重大的應用價值,是四大酶制劑之一[3]。目前中國果膠酶的生產主要采用固體發酵,但是固體發酵產生的雜蛋白較多,分離純化成本較高,回收率較低,其產品的質量及產量較難達到食品行業的使用要求[4]。所以在液體發酵產果膠酶方面也有較多的研究,如Tari[5]采用Aspergillus sojae ATCC 20235液體發酵產果膠酶;尤華[6]利用Aspergillussp.XZ-131液體發酵產果膠酶,通過正交實驗優化培養基,最終酶活達300 U/mL;楊欣偉等[7]利用E IM-6菌株通過響應面法優化了液體發酵產果膠酶的條件,酶活提高了2.07倍。由于響應面分析法可以對影響產量的因子水平及其交互作用進行優化與評估,可以有效確定最佳生產條件,所以本研究在單因素的基礎上利用該方法對草酸青霉產果膠酶的培養基進行了優化,得到最佳培養基配方,提高了果膠酶活性[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗室分離篩選獲得的高產果膠酶的草酸青霉(Penicillium oxalicum)L5菌株。

1.1.2 培養基 ①斜面一級種子培養基:馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA);②搖瓶種子培養基:果膠4 g,(NH4)2SO41 g,KH2PO43.8 g,K2HPO4·3H2O 0.2 g,水100 mL,pH 6.0;③搖瓶基礎培養基:桔皮粉4 g,米糠4 g,(NH4)2SO41 g,KH2PO43.8 g,K2HPO4·3H2O 0.2 g,水100 mL,pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養 將經PDA試管斜面培養后的菌株,用無菌水配成1.0×106個/mL孢子懸浮液,按5%的接種量(體積比)接入種子搖瓶培養基中,回轉式搖床轉速160 r/min,28℃,培養24 h后,取一定量的種子液接入搖瓶培養基,繼續培養70 h。裝液量均為250 mL三角瓶中裝40 mL。1.2.2 粗酶液的提取 發酵液在4℃,10 000 r/min離心10 min,取上清液作為粗酶液。

1.2.3 酶活測定 采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)法[9],規定每毫升果膠酶液降解果膠底物每分鐘產生1μg還原糖為1個酶活單位。

1.2.4 單因素實驗 以搖瓶基礎培養基為配方,按照上述搖瓶培養的方法,分別以碳源、氮源、接種量及搖瓶初始pH為單因素進行實驗,測定果膠酶活性。

1.2.5 優化實驗[10]在單因素的基礎上,選擇影響較顯著的桔皮粉含量(A)、米糠含量(B)、硫酸銨含量(C)為響應面的考察因素,以果膠酶產量(Y)為響應值,采用Minitab 15軟件進行數據處理,對液體發酵產果膠酶的工藝參數進行優化。RS M實驗設計因素水平見表1。

1.2.6 酶學特征[8]①反應溫度對酶活的影響:將粗酶液分別置于30、40、50、60、70、80、90℃下測量其酶活;②熱穩定性:將粗酶液分別在30、40、50、60、70℃溫水浴下保溫1、2、3、4 h后分別測定其酶活;③反應pH對酶活的影響:配制pH 3.0～9.0的果膠底物溶液,分別測定在不同pH情況下的酶活;④pH穩定性:將粗酶液分別在pH值為4.0～8.0的緩沖液中處理1、2、3、4 h,分別測定其酶活。

表1 RSM實驗設計因素水平Table 1 Factors of response surface method and its level

2 結果與分析

2.1 液體發酵產果膠酶的單因素實驗

分別研究了添加不同的碳源(桔皮粉、柚子皮粉、香蕉皮粉等)和不同的碳源添加量;不同的氮源(硫酸銨、硫酸銨+米糠、米糠等)和不同的氮源添加量;接種量;搖瓶初始pH等對L5菌株液體發酵產果膠酶的影響。結果顯示(圖1),在添加的碳源中,桔皮粉為最適碳源,添加量以5%為宜;在10種氮源中,添加復合氮源米糠+硫酸銨時,果膠酶活最佳,此外,硫酸銨、蛋白胨和牛肉膏也是較適合的氮源,其中米糠的添加量為6%,硫酸銨的添加量為1%;接種量為9%時果膠酶產量最佳;較適宜的初始pH在6.0～8.0左右。

2.2 液體發酵產果膠酶的優化實驗

在單因素的基礎上,采用Minitab 15軟件,以桔皮粉含量、米糠含量、硫酸銨含量為自變量,果膠酶產量為響應值設計RS M實驗,其實驗結果見表2。最終擬合的回歸方程如下:Y=-460 130+138 200A+53 266.2B+46 168.1C-15 247.76A2-4 769.55B2-29 403.7C2+960.830AB+4 322.01AC-1 701.47BC。由表3、表4可知,回歸極顯著(P<0.001),失擬不顯著(P=0.241>0.05),該回歸方程高度顯著,能很好地對響應值進行預測。在考察的因素中A、A2、B2、C2表現為極顯著(P<0.001),說明它們對響應值的影響極大及其考察的因素對響應值的影響不是簡單的一次線性關系。

圖1 不同因素對果膠酶產量的影響Fig.1 The effect of different factors on the pectinase-producting

表2 RSM實驗項目及結果Table 2 The experimentproject and resultsofResponse surfacemethod

表4 方差分析結果Table 4 Results of regression analysis

通過Minitab 15分析,繪制出等高線及曲面圖2～5,直觀地反映出了各因素的交互作用對響應值的影響,由圖可知各因素存在極點值。同時,通過進一步繪制優化圖,得出產果膠酶的最佳條件:桔皮粉4.848 5%、米糠5.888 9%、硫酸銨0.974 7%,此時的果膠酶產量預測值為54 924.00 U。考慮到實際操作的現實性,將最佳條件修正為桔皮粉4.85%、米糠5.89%、硫酸銨0.97%,進行3次平行實驗,得到的果膠酶產量分別為54 964.29、53 246.53、54 964.29 U,平均產量為54 391.70 U,與預測產量無顯著差別,證明此次RS M實驗參數準確可靠,具有實用價值。

圖2 果膠酶產量與米糠、硫酸銨的等值線及曲面圖Fig.2 The isogram and surface chart of pectinase-producting on rice bran and(NH4)2SO4

圖3 果膠酶產量與桔皮粉、硫酸銨的等值線及曲面圖Fig.3 The isogram and surface chart of pectinase-producting on citrus peel powder and(NH4)2SO4

圖4 果膠酶產量與桔皮粉、米糠的等值線及曲面圖Fig.4 The isogram and surface chart of pectinase-producting on citrus peel powder and rice bran

圖5 果膠酶產量與桔皮粉、米糠、硫酸銨的優化圖Fig.5 The optimization figure of pectinase-producting on citrus peel powder,rice bran and(NH4)2SO4

2.3 酶學特性

2.3.1 反應溫度對酶活的影響及其熱穩定性圖6A可知,當反應溫度為30～50℃時,酶活上升;反應溫度為50～90℃時,酶活下降。由圖6C可知,酶在30～50℃時有較好的熱穩定性,并且在此范圍內,溫度在50℃時,酶活達最大值。

2.3.2 反應pH對酶活的影響及其熱穩定性圖6B顯示,在pH范圍為3.0～5.0時,酶活隨著酶作用的底物pH增大而上升;在pH范圍為5.0～9.0時,酶活隨著酶作用底物pH的增大而下降。由圖6D可見,酶在pH值為4.0～6.0的范圍內有較好的穩定性,pH值為5.0時穩定性最佳,并且當底物pH為5.0時酶活力達到最大值。

圖6 L5菌株的酶學性質Fig.6 The enzymatic properties ofL5

3 討 論

在碳源篩選過程中選擇了多種果皮粉及可溶性糖類,結果表明桔皮粉等含果膠的有機物質作為碳源時促進產酶;而葡萄糖等可溶性糖類作為碳源時,酶活較低,可能是因為其分解產物阻遏了酶的合成[11]。桔皮粉作為碳源的同時,又作為誘導劑,促進了酶的合成[12]。氮源的篩選結果表明,同時添加無機氮源(NH4)2SO4和有機氮源米糠時更有利于酶的合成。其中米糠主要起到持效氮源的作用,硫酸銨則起到速效氮源的作用,這樣的組合更有利于草酸青霉持續快速的生長和發育[7]。

本研究通過單因素實驗及RS M優化,得到該菌株在桔皮粉4.85 g,米糠5.89 g,(NH4)2SO40.97 g,KH2PO43.8 g,K2HPO4·3H2O 0.2 g,水100 mL,初始pH 6.0,溫度28℃,搖床轉速160 r/min,接種量9%,培養70 h時酶活最高,最終可達54 391.70 U,較原來提高了3倍。在草酸青霉液體發酵產果膠酶的研究中處于較高水平。

對草酸青霉菌株在液體發酵提取液中果膠酶的酶學性質進行了探討,結果顯示該酶的最適反應溫度為50℃,最適反應pH為5.0,在30～50℃時有較好的熱穩定性,在pH值為4.0～6.0的范圍內有較好的穩定性,pH值為5.0時穩定性最佳。與彭霞薇等[13]對草酸青霉BZH_2002果膠酶酶特性的研究結果略有不同。

本研究的菌株利用浙江來源豐富的桔皮和米糠作為搖瓶培養基,不僅實現了廢物再利用,同時可以使其高產,可見對該菌株的研究具有潛在的應用價值。

[1] Lund B.M..Bacterial spoilage of vegetables and certain fruits[J].Journal ofAppliedMicrobiology,1971,34(1):9-20.

[2] PandeyA.,Soccol C.R.,MitchellD..New developments in solid state fermentation:I-bioprocess and products[J].Process Biochemistry,2000,35(10):1153-1169.

[3] 許均華,李高陽,李志堅.高產果膠酶菌株的選育及其發酵生產的研究進展[J].食品與機械,2011,27(1):146-150.

[4] 張浩森,繆靜,余曉斌.幾種因素對黑曲霉產果膠酶不同酶系的影響[J].食品工業科技,2008,29(1):57-60.

[5] Tari C,Gogus N,Tokafli F.Optimization of biomass,pellet size and polygalae-turonase production byAspergillus sojae ATCC 20235 using response surface methodology[J].Enzyme andMicrobial Technology,2007,40(5):1108-1116.

[6] 尤華,陸兆新,馮紅霞.曲霉液體發酵產原果膠酶的條件優化研究[J].微生物學通報,2003,30(1):26-30.

[7] 楊欣偉,林偉鈴,田寶玉,等.果膠酶高產菌株E IM-6的篩選鑒定及其液體發酵產酶條件優化[J].福建師范大學學報(自然科學版),2009,25(2):68-74.

[8] 楊秀榮,王雪蓮,王敏,等.利用響應面分析方法優化生防細菌B579增殖培養基[J].微生物學雜志,2010,30(3):35-39.

[9] 張浩森,繆靜,余曉斌.果膠酶高產菌株的篩選及產酶條件的研究[J].生物學雜志,2008,25(1):28-30,46.

[10] 尹利,閻金勇,楊江科,等.響應面法優化洋蔥假單胞菌產脂肪酶液體發酵工藝[J].微生物學雜志,2007,27(3):11-15.

[11] 林樹花,李高陽,譚歡,等.果膠酶高產菌選育研究進展[J].農產品加工·創新版,2009(12):53-58.

[12] 劉明啟,劉光富,戴賢君,等.優化米曲霉固體發酵產果膠酶及產物酶學性質[J].中國計量學院學報,2010,21(2):146-151.

[13] 彭霞薇,謝響明,白志輝,等.草酸青霉BZH-2002產果膠酶特性研究[J].生物技術,2005,15(6):27-30.