1株纖維素降解菌的篩選及產酶條件研究

孟建宇,馮福應,劉向紅,郭思文

(內蒙古農業大學生命科學學院應用與環境微生物實驗所,內蒙古呼和浩特 010018)

纖維素是地球上分布最廣的碳水化合物,同時又是自然界中數量最大的可再生資源[1]。我國農作物秸稈和纖維素廢棄物年產量逾6億t[2],然而由于難以大量被動物分解利用,大部分以堆積、荒燒等形式直接傾入環境,造成極大的污染和浪費。利用微生物降解纖維素因具有經濟、有效、節約等優點而成為當今有效地開發利用纖維素資源的熱門課題[3-4]。大規模纖維素生物轉化工藝的發展,將有效解決或減輕食品和動物飼料的不足、廢棄物處理、礦石燃料依賴性等一系列問題[5]。自然界中能夠降解纖維素的微生物很多[6],但研究較多的主要是絲狀真菌和細菌。而放線菌可耐高溫和各種酸堿度,目前許多研究者正致力于放線菌產纖維素酶的研究[7]。近些年關于產纖維素酶菌株的篩選研究很多,但真正高產量的菌株并不多見,纖維素酶的生產依然是低產量高成本的狀態[8],進一步選育高產纖維素酶菌株的研究亟待進一步開展。本文從常年堆積秸稈的土壤中篩選到1株高纖維素酶活的纖維素降解菌并對其產酶條件進行了初步研究,為纖維素資源的有效降解和合理利用提供一些基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集自呼和浩特市郊區有腐爛秸稈堆積物的土壤。

1.1.2 培養基 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養基:CMC-Na 15 g,KH2PO41 g,NH4NO31 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,酵母膏1 g,(瓊脂粉15 g,固體培養基用),H2O 1 000 mL;纖維素剛果紅培養基[9]:KH2PO40.5 g,MgSO40.25 g,微晶纖維素1.88 g,明膠2 g,瓊脂15 g,樣品浸液100 mL,H2O 900 mL,pH 7.0;赫奇遜培養基:KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,CaCl20.1 g,NaCl 0.1 g,FeCl30.01 g,NaNO32.5 g,H2O 1 000 mL,pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選 將樣品溶于無菌水中,系列稀釋,涂布于纖維素剛果紅培養基上,30℃培養,菌落呈紅色并且能在周圍形成透明水解圈的菌株即能產纖維素酶的菌株。挑選生長快、紅色濃郁且水解圈大的菌落分別接種于含處理的濾紙條[9]的赫奇遜培養基中,30℃,140 r/min培養5 d。挑選將濾紙條分解斷裂快的培養物在纖維素瓊脂培養基上涂板、劃線,反復篩選純化菌株。將產纖維素酶的菌株劃線分離純化,接種至以CMC-Na為唯一碳源的液體培養基中搖床發酵,測定各菌株的纖維素酶活進行復篩。

1.2.2 菌株的鑒定 ①形態和生理生化特征:菌株的生理和生化特征實驗測定方法及初步的鑒定見《鏈霉菌鑒定手冊》[10];②16S rRNA序列分析:提取細菌總DNA[11],用凝膠回收試劑盒(北京中科瑞泰)進行純化。選用細菌通用引物對63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和1387R[12](5′-GGGCGGTG(A/T)GTACAAGGC-3′)進行PCR擴增。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應體系:1μL DNA模板(約50 ng/μL),0.1μL r-Taq酶,2μL 10×Buffer,1.6 μL dNTP(20 mmol/L),引物(20μmol/μL)各0.2 μL,Mg2+終濃度為1.5 mmol/L,補水使總體積至20μL。反應程序:94℃預變性3 min,然后進入以下循環:94℃45 s,55℃30 s,72℃1.5 min,30個循環后72℃延伸5 min。16S rDNA PCR產物經膠回收,純化產物與pMD19-T(大連寶生物)載體16℃過夜連接,轉化E.coliDH5α。轉化細胞涂布于含50μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,37℃培養16 h。挑取陽性克隆子,用M13(M13+5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′、M13-5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)引物進行菌落PCR擴增重組質粒檢測,將陽性克隆擴培后由北京華大基因有限公司測序。測序結果在GenBank中進行同源性比較,用DNA Star軟件的ClustalW法進行相似性比較分析,用Mega3.1的鄰接法構建進化樹[13]。

1.2.3 粗酶液的制備 在CMC固體培養基上活化菌種,挑取單菌落于CMC液體培養基中30℃,140 r/min振蕩搖床培養,培養液于4℃下,5 000 r/min離心30 min,上清液即為粗酶液。加入硫酸銨至70%的飽和度,4℃靜置過夜,離心(10 000 r/min,4℃,15 min),收集沉淀,所得沉淀用適量50 mmol/L CMC緩沖液(pH 4.4)溶解后,在相同緩沖液中4℃透析16 h,然后在10 000 r/min,4℃下離心15 min,取上清液待用。

1.2.4 纖維素酶活的測定 本實驗采用DNS法[14]對纖維素酶活進行測定。將過濾后的酶液稀釋5倍,吸取0.1 mL加入試管,加CMC緩沖液(50 mmol/L,pH 4.4)0.3 mL混勻。放入50℃恒溫水浴中糖化30 min,取出后加入DNS試劑0.3 mL,沸水浴中煮沸5 min,在冷水中冷卻,用蒸餾水定容至5 mL,在540 nm處比色。酶活定義:在pH 4.4,50℃下,每1 mL酶液在1 min內水解CMC-Na生成1μg葡萄糖的酶活性為1個纖維素酶活力(CMC酶活)單位(U)。酶活的計算:

其中,G:樣品中葡萄糖含量(μg);B:酶液稀釋倍數;0.1:吸取酶液的數量(mL);30為糖化時間(min)。

1.2.5 不同氮源對酶活性的影響 在CMC-Na液體培養基中分別以蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨作為唯一氮源,將L006菌接種于不同氮源培養基中,30℃、140 r/min搖床培養提取粗酶液,按照1.2.4的方法每隔24 h測定酶活性。每組作3個重復。

1.2.6 不同碳源對酶活性的影響 在CMC-Na液體培養基中分別以濾紙、秸稈和CMC-Na作為唯一碳源,將L006菌接種于不同碳源培養基中,30℃、140 r/min搖床培養提取粗酶液,按照

1.2.4 的方法每隔24 h測定酶活性。每組作3個重復。

1.2.7 不同pH對酶活性的影響 用1 mol/L的HCl或NaOH溶液調節培養基的pH值分別為6.5、7.0、7.5,接種L006菌株培養并測定酶活性。每組作3個重復。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選與鑒定

通過反復初篩和復篩,最終獲得1株分解纖維素能力較強的優良菌株L006。菌落圓形,有凸起,白色,干燥,邊緣整齊,中間略帶粉色。孢子圓形白色,G+。能使明膠液化,淀粉水解,牛奶胨化,可以利用葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、乳糖等。根據16S rRNA序列比較推測細菌間進化關系,構建進化樹(圖1),進而對未知菌株進行鑒定。發現L006菌株與Actinobacterium220215.seq有97.8%的同源性,與Streptom yces的3個比對菌株都有97.9%的同源性(圖2),初步確定其屬于鏈霉菌屬。

圖1 菌株L006的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain L006

圖2 L006菌株與4種比對菌的16S rRNA基因的相似性Fig.2 Similarity of 16S rRNA between L006 and 4 relative species

2.2 生長曲線

將菌種接種到以CMC-Na為碳源的培養基中進行培養,繪制生長曲線(圖3)。由圖3可見,從24 h開始,菌體的生長開始進入對數期,其OD值為0.757,到60 h時,OD值達到峰值,為1.208。在36～84 h內,菌體繁殖速度快,代謝旺盛,在此期間進行接種和酶活的測定較為理想。從96 h后,由于代謝物的積累和培養基營養物質的缺乏,菌體的生長進入衰退期,生長速率下降。

2.3 不同氮源、碳源對纖維素降解菌產酶的影響

不同碳、氮源對纖維素降解菌產酶的影響較大。在24～96 h內,生長在不同碳、氮源組合的培養基中菌株的酶活性均呈上升趨勢,在96 h達到最高峰,96 h后,酶活性均開始下降。當碳源為濾紙(圖4)和CMC-Na(圖5)時,以蛋白胨為氮源時產酶最佳,酶活性最大值分別為47.9 U/mL和41.5 U/mL,而以硝酸鉀為氮源時僅為27.2 U/mL和28.5 U/mL。當碳源為秸稈(圖6)時,產酶效果最佳,酶活性遠遠超過其他碳源的情況。其中仍以蛋白胨為氮源時產酶最好,96 h最高酶活為220.6 U/mL。綜合來看,以蛋白胨為氮源、以秸稈為碳源是產酶的最佳條件組合。

圖3 L006的生長曲線Fig.3 The growing curve ofL006

圖4 碳源為濾紙時,不同氮源對L006產酶的影響Fig.4 Effects of different nitrogen source on production of cellulase by strain L006 when carbon source was filter paper

2.4 pH對纖維素降解菌產酶的影響

將以蛋白胨為氮源和以秸稈為碳源的培養基pH值調整為6.5、7.0、7.5,找到較適合的pH值,從而綜合碳源、氮源和pH值3個因素,找到最適合的產酶條件。從圖7可以看出,在培養24 h后菌體在3個pH下的酶活力基本相同。在24～48 h內,pH 6.5和pH 7.5的培養基中菌體生長較為緩慢,酶活變化不明顯,而生長在pH 7.0的培養基中的菌體生長較旺盛,酶活值上升趨勢較為明顯,在48 h時,達到最大值220.1 U/mL。48 h后,pH 7.0的酶活開始下降,而pH 6.5和pH 7.5的酶活呈平穩的上升趨勢,在72 h時,pH 7.5的酶活達到最大,最大值為209.1 U/mL。72 h后,pH 7.5酶活力開始下降,而pH 6.5酶活力仍在增長,在96 h時,達到最大值為210.3 U/mL。

圖5 碳源為CMC-Na時,不同氮源對L006產酶的影響Fig.5 Effects of different nitrogen source on production of cellulase by strain L006 when carbon source was CMC-Na

圖6 碳源為秸稈時,不同氮源對L006產酶的影響Fig.6 Effects of different nitrogen source on production of cellulase by strain L006 when carbon source was straw

圖7 pH值對L006產酶的影響Fig.7 Effects of initial pH on production of cellulase by strain L006

3 討 論

碳源是微生物生長繁殖所必需的營養物,微生物細胞含碳量約占干重50%,故除水分外,碳源是需要量最大的營養物。氮是組成蛋白質和核酸的主要元素。酶的本質是蛋白質,微生物的生長代謝也離不開氮源。雖然氮源并不作為誘導纖維素酶的誘導物,但對菌體的迅速增長有很重要的作用。設計不同的碳、氮源的培養基培養纖維素降解菌L006,發現以秸稈為碳源、以蛋白胨為氮源的培養基是最佳碳、氮源組合的培養基。在96 h,酶活最大,為220.6 U/mL。碳源中,秸稈為L006菌株最佳碳源,濾紙和CMC-Na次之;氮源中,蛋白胨為最佳,銨態氮和硝態氮次之,銨態氮優于硝態氮。pH值對菌體的生長和產酶也有著巨大的影響。以秸稈為碳源、以蛋白胨為氮源的培養基培養L006菌株,當初始pH=7.0時,產酶最佳,在48 h,其酶活達到最大值220.1 U/mL。

纖維素酶作為一種多組分酶系[2,7],不同生產菌種所產的纖維素酶的作用效果也同樣受到溫度、酶解時間、酶用量和酶解底物濃度等因素的影響。因此,應綜合考慮后確定產酶條件。

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