西北部分地區苦馬豆根瘤菌的表型多樣性研究

徐 琳,龔明福,韋革宏＊

(1.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.西北農林科技大學,陜西楊凌 712100;3.河西學院生物系,甘肅張掖 734000)

根瘤菌是土壤中廣泛分布的重要微生物類群,它與豆科植物的共生是固氮中效能最高的體系。近年來,對根瘤菌資源和其固氮機理的研究正在逐步廣泛和深入,新的屬種不斷被發現[1-3]的同時,也發掘并保藏了一大批具有優秀抗逆品質的根瘤菌菌種。苦馬豆廣泛分布于我國西北地區,其根系發達,是優良的保土固沙植物,由于能與根瘤形成共生體,使得其抗逆能力有效提高。全世界有2種[4]苦馬豆,主要分布于西亞、中亞、東亞、西伯利亞及大洋洲,我國僅產1種,為苦馬豆(Sphaerophysa salsula),主要分布于我國西北干旱半干旱地區。目前對苦馬豆根瘤菌的研究極少,僅有徐琳等[5]對苦馬豆根瘤菌進行了多樣性和系統發育研究,而對其表型多樣性并未進行深入研究。本研究擬采用表型性狀測定及數值分類,旨在發掘一大批具有優良性狀的根瘤菌菌株,為豐富我國根瘤菌菌種資源庫、探索受損生態系統恢復重建及鄉土植物資源生態產業化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗共選取根瘤菌55株,其中48株未知菌株分別來自甘肅、寧夏和新疆[5],另外7株為參比菌。未知菌株編號、宿主和地理來源見表1。

1.1.2 參比菌株 選取已知參比菌株7株(見表2),與供試菌株同時測定生理生化性狀。

表1 供試菌株編號及來源Table 1 List of bacterial strains tested and their origins

表2 參比菌株及來源Table 2 The reference strain and their origins

1.2 方法

1.2.1 性狀分析 實驗共測定表型性狀113項,其中唯一碳源利用24項;唯一氮源利用13項;抗生素敏感性28項;染料抗性測定14項;其他測定項目有耐鹽性、初始pH、溫度生長范圍、硝酸鹽還原、耐爾藍還原、BTB酸堿反應、過氧化氫酶、L-苯丙氨酸脫氫酶測定尿酶、肉湯生長等,每個性狀設3個重復[6]。

1.2.2 聚類分析 用NTSYSpc軟件按照平均連鎖法(UPG MA)進行聚類,結果以樹狀圖譜方式表示。

1.2.3 表觀群中心菌株的確定 采用最大平均數法,計算群內菌株的相似性系數,求平均值,平均值最大的即為該表觀群的中心菌株[7]。

2 結果與分析

2.1 生理生化測定結果

2.1.1 唯一碳源的利用 蔗糖、肌醇、L-鼠李糖、葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、海藻糖、麥芽糖可被全部測試菌株利用;95%菌株可利用D-山梨醇、蜜二糖、L-樹膠醛糖、半乳糖、乳糖、L-阿拉伯糖;CCNWGS0174、CCNWGS0199、CCNWXJ0221、CCNWXJ0219、CCNWXJ0216、CCNWGS0236、CCNWGS0209、CCNWGS0185、CCNWGS0197、CCNWGS0224這10株菌除L-山梨糖外,其余供試碳源均可利用,說明這些菌株的糖酵解底物范圍比較廣泛。結果表明:大多數供試菌株能以不同形式的單糖或二糖作為生長的良好碳源。

2.1.2 唯一氮源的利用 DL-組氨酸不能作為所用供試菌株的唯一氮源,而參比菌株USDA2914、USDA1002、CCBAU71714則可利用DL-組氨酸;L-天冬氨酸、L-正白氨酸、L-苯丙氨酸、L-白氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸可被全部測試菌株利用;90%菌株可利用L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甘氨酸、L-賴氨酸、DL-氨基丙酸作為唯一氮源。參比菌株USDA2914可利用全部供試氮源。

2.1.3 抗生素抗性測定 所有測試菌株對林可霉素(5、50μg/mL)具有抗性,90%測試菌株對卡那霉素(5μg/mL)、氯霉素(5μg/mL)、硫酸阿米卡星(5μg/mL)、林可霉素(100、300μg/mL)具有抗性,能在含其濃度抗生素培養基上正常生長,但隨抗生素濃度的增加菌株的生長受到不同程度的抑制,當鏈霉素濃度增加至300μg/mL、卡那霉素濃度增加至100μg/mL、阿奇霉素濃度增加至50μg/mL、硫酸阿米卡星濃度增加至50μg/mL時,所有測試菌株的生長受到抑制。40%菌株能耐高濃度的青霉素(300μg/mL),CCNWGS0174和CCNWXJ0216能耐高濃度的氯霉素(300μg/mL),95%菌株能耐高濃度的林可霉素(300μg/mL)。

2.1.4 對染料及化學藥物的耐性測定 88%菌株對染料甲基藍(0.1%、0.2%)、溴百里酚藍(0.1%、0.2%)、剛果紅(0.1%、0.2%)和中性紅(0.1%)不敏感,能在含其培養基上正常生長;所有測試菌株均不能耐受0.2%的亞甲基藍、0.2%的甲基紅及0.2%的孔雀石綠。除USDA2914、SDW014、USDA3306、SH2672205 4株參比菌株外,其他供試菌株均可在含有0.4%亞硝酸鈉的培養基上正常生長;僅有4%的菌株不能在含有0.2%去氧膽酸鈉的培養基中生長。

2.1.5 耐鹽性、初始pH、溫度生長范圍測定 除參比菌株SDW014、USDA3306外,全部供試菌株能耐1%的NaCl,80%菌株可以耐2%、3%的NaCl,55%菌株可以耐4%、5%的NaCl,35%菌株可以耐6%的NaCl。全部測試試菌株在pH 4、pH 5的酸性環境中不能生長;除參比菌株SDW014、USDA3306、SH2672205外,其余菌株均可在pH 9～12的堿性環境中生長。全部測試菌株在4℃時不生長;除參比菌株外,其余菌株均可在10℃時生長;47%菌株在40℃時可以生長。將菌株60℃處理30 min、70℃處理10 min后置28℃培養,95%菌株可正常生長;而在進行60℃處理1 h、70℃處理30 min及70℃處理1 h后,分別有24%、55%菌株及0%的菌株生長。

2.2 數值分類結果

從聚類圖(圖1)可以看出全部測試菌株在43.5%的相似水平上聚在一起,未知供試菌株在56%的相似水平上聚在一起。所有未知菌株在72%的相似水平上分為5個群。群Ⅰ有39株菌,在74.6%相似水平聚合,中心菌株為CCNWGS0215;群Ⅱ有5株菌,在76%相似水平聚合,中心菌株為CCNWGS0228;群Ⅳ包括了CCNW0172和CCNW0173 2株菌,在81.5%的相似水平上聚合;群Ⅲ和V群分別有1株菌,在68.5%和56.5%的相似水平上與其他供試菌株明顯區分。

圖1 數值分類樹狀圖Fig.1 Dendrogram of the rhizobial strains in numerical taxonomy

2.3 各類群之間的鑒別特征

表3 各類群之間的鑒別特征Table 3 Characteristics of identification among clusters

從表3各類群的鑒別特征統計結果可以看出:第Ⅲ、Ⅳ類群的菌株幾乎對糖原和D-木糖均不能利用,而第Ⅰ、Ⅱ類群有80%以上的菌能夠利用它們作為唯一碳氮源;第Ⅰ類群的菌株對青霉素不敏感,而其他3個群的菌株對其敏感。第Ⅳ類群的菌株對氯化鈉(6%),中性紅(0.2%),青霉素(300 mg/mL)及氯霉素(50μg/mL)的耐受性較低,而群Ⅰ對這些指標的耐受度較高。這些鑒別特征是它們獨立成群的主要依據。

3 討 論

生理生化測定結果表明,供試的48株根瘤菌絕大多數菌株能利用不同形式的單糖或二糖作為生長的良好碳源,對供試抗生素及染料有較好的抗性,所有的菌株均具有較強的耐鹽堿能力,全部未知菌株均可耐受pH 12的強堿性環境。Janet[8]和Mohammad等[9]認為,根瘤菌在抗干旱和抗鹽堿方面具有相關性,陳利云等[10]研究表明,抗旱性強的根瘤菌耐鹽堿能力也較強。供試菌株所體現出的性狀與其寄主植物的生存環境密切相關,植物采樣地為西北干旱半干旱區,氣候為大陸荒漠氣候區,絕大部分樣區位于鹽堿地或荒漠地,與它們所共生的根瘤菌所具有的特殊生理性狀是其在長期逆境脅迫下,經過雙重選擇,逐漸進化、適應生態環境的結果。

通過對數值分類的分析表明,全部未知供試菌株在72%的相似水平上分為5個表觀群,顯示了供試菌株豐富的表型多樣性。除USDA 2914、USDA 1002及CCBAU71714可與類群Ⅰ在77%的相似水平上聚群外,其他參比菌株與未知菌株的相似性都較低,表明供試菌株與參比菌株差別較大。未知菌株均為革蘭陰性,無芽胞,多數菌株可利用D-木糖、乳糖、丙酸鈉、L-阿拉伯糖、D-果糖、蜜三糖、鼠李糖、甘露糖、有機酸、檸檬酸鹽、醋酸鈉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、酒石酸鈉和肌醇,但不能以D-山梨醇為唯一碳源。可利用L-胱氨酸、甲硫氨酸、L-丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、白氨酸、精氨酸及腺嘌呤作為唯一氮源。最佳生長溫度為28℃,溫度60℃以上時生長受到抑制,最適pH為7～10。對0.1%甲基綠、5μg/mL阿奇霉素、50 μg/mL卡那霉素和50μg/mL阿米卡星敏感。是否屬于潛在的新種,需要進一步驗證。

從聚類圖還可以得出:同一地理來源的菌株具較高的相似性,并聚到同一個類群,如群Ⅳ的CCNWNX0172和CCNWNX0173 2株菌均來源于寧夏銀川,它們的相似性達95%。不同地理來源的菌株具較高的相似性,可以聚到同一個類群,如群Ⅰ的28株菌中包括了分離自新疆的4株菌株和來源于甘肅省張掖市的24株菌,它們在92%相似性水平上聚群。上述現象表明,根瘤菌與豆科植物之間的共生結瘤關系受到地理來源和生態環境的影響,這一結果與陳文新等[11]的觀點一致。

[1] Zhang GX,Ren SZ,Xu MY,et al.Rhizobium borborisp.nov.,an aniline-degrading bacterium isolated from activated sludge[J].Int J Syst EvolMicrobiol,2010,doi:10.1099/ijs.0.022228-0.

[2] Zhang RJ,HouBC,Wang ET,et al.Rhizobium tubonensesp.nov.,a symbiotic bacterium isolated from root nodulesofOxytropis glabra grown in Tibet,China[J].Int J Syst EvolMicrobiol,2010,doi:10.1099/ijs.0.020156-0.

[3] Ren DW,Chen WF,Sui XH,et al.Rhizobium vignaesp.nov.,a symbiotic bacterium isolated from multiple legume species grown in China[J].Int J Syst EvolMicrobiol,2010,doi:10.1099/ijs.0.023143-0.

[4] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志第42卷:第1分冊[M].北京:科學出版社,1993:6-9.

[5] 徐琳,徐家潔,劉巧莉,等.西北部分地區苦馬豆根瘤菌的遺傳多樣性[J].生物多樣性,2009,17(1):69-75.

[6] 萬曉紅,韋革宏,楊亞珍,等.紫花苜蓿品種根瘤菌表型多樣性研究[J].草地學報,2004,12(4):276-280.

[7] 韋革宏,陳文新,朱銘莪.陜甘寧地區根瘤菌數值分類與DNA同源性分析[J].應用與環境生物學報,1999,5(1):73-78.

[8] Janet J.Effect of heat stress on cell activity and cellmorphology of the tropical rhizobium[J].FEMS Microbiology Ecology,2001,34(3):267-268.

[9] Mohammad R M,Akhavan KM,CapbellW F,et al.Identification of salt-and drought-tolerant rhizobiummeliloti L,strains[J].Plant and Soil,1991,134(2):271-276.

[10] 陳利云,張麗靜,周志宇.耐鹽根瘤菌對紫花苜蓿接種效果的研究[J].草業學報,2008,17(5):43-47.

[11] 陳文新,汪恩濤,陳文峰.根瘤菌-豆科植物共生多樣性與地理環境的關系[J].中國農業科學,2004,37(1):81-86.