幽門螺桿菌感染蒙古沙土鼠疾病模型的建立

謝獻勝，劉 孟，王小波，李建基， 彭大新

（1.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇畜牧獸醫職業技術學院，江蘇泰州 225300）

幽門螺桿菌感染蒙古沙土鼠疾病模型的建立

謝獻勝1，2，劉 孟1，王小波1，李建基1， 彭大新1

（1.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇畜牧獸醫職業技術學院，江蘇泰州 225300）

利用蒙古沙土鼠建立幽門螺桿菌（Helicobacterpylori,Hp）NCTC 11637株胃內感染模型。感染方法有兩種，方法Ⅰ是沙土鼠禁食18h后用50%酒精0.5mL預處理，6h后接種H p，間隔12h、24h分別再次接種。方法Ⅱ的接種方法同方法Ⅰ，但接種后每日口服雷尼替丁（5mg/k g體重）。胃內接種H p后，于第7天、15天、35天、45天分別用H p抗原酶聯免疫診斷試劑盒、細菌培養和胃組織切片的方法觀察沙土鼠胃內細菌感染情況和胃病理組織學變化。結果表明，給沙土鼠胃內灌服酒精以損傷胃黏膜并每日口服雷尼替丁，在人工接種35天后，胃內見有多量H p生長，胃組織病變與H p自然感染的病例相似。

幽門螺桿菌；感染；蒙古沙土鼠；疾病模型

自1983年澳大利亞學者Warren和Marshall成功地從人胃黏膜樣品中分離到幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）以來，Hp及其相關胃、十二指腸疾病的研究一直是近20年來胃腸病學的熱點課題[1]。Hp是一種定植在人胃中的非常多見的病原體，并與慢性活動性胃炎、消化性潰瘍和黏膜淋巴樣組織淋巴瘤密切相關[2]。幽門螺桿菌感染動物模型在篩選抗Hp特異藥物與防治方法、Hp疫苗研制等方面具有重要意義。迄今已報道建立小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂、猴、比格犬、小型豬等動物Hp感染動物模型[3,4,5]。有關Hp感染蒙古沙土鼠疾病模型的制作方法及其效果，資料之間存在較大的差異。本實驗對利用蒙古沙土鼠制作Hp胃內感染疾病模型的方法及其效果作了探討，現介紹如下。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養

Hp菌種（NCTC11637）由上海消化道研究所提供；培養基為含8%山羊血的哥倫比亞血瓊脂，含 TMP5mg/L，多粘菌素 2500U/L，萬古霉素10mg/L。微需氧條件培養3-5天[6]。菌種復蘇后用布氏肉湯液體培養基培養5天并做細菌計數，然后，用布氏肉湯液稀釋至1×109CFU/mL。

1.2 實驗動物

蒙古沙土鼠48只，2月齡，體重80g左右。隨機分為3組，Ⅰ組是對照組，8只；Ⅱ組、Ⅲ組是實驗組，20只/組；雌、雄各半。

1.3 Hp胃內感染的方法

蒙古沙土鼠禁食禁水24h（在禁食禁水18h后灌服50%酒精0.5mL/只），對照組每次灌服生理鹽水1mL；實驗組灌胃接種Hp3次，Ⅱ組、Ⅲ組每只蒙古沙土鼠接種細菌1mL（109CFU/mL），12h后第二次接種，24h后第三次接種，最后一次接種4h后開始飼喂[7,8]。Ⅰ組、Ⅱ組常規飼喂，Ⅲ組飼料中加入雷尼替丁（每天5mg/kg體重）。

1.4 Hp分離培養和鑒定

于最后一次灌胃后的第7天、15天、35天、45天分別取實驗鼠胃和十二指腸球部進行Hp檢測。Ⅰ組每次取2只，Ⅱ組、Ⅲ組每次各取5只。實驗鼠斷頸椎處死后，無菌取胃和十二指腸球部。縱向對稱剪開胃和十二指腸。一半樣品與布氏肉湯液體培養液勻漿后用于細菌鑒定培養和試劑盒檢測，另一半用于病理組織學檢查（10%中性福爾馬林固定）[9,10]。

1.5 病理學檢查

取胃竇，胃底和十二指腸球部做組織切片并作HE和銀染色[11]。觀察炎癥變化和Hp定植情況。

2 結果

2.1 Hp抗原酶聯免疫法診斷試劑盒測試結果

接種細菌后第7天和第15天，Ⅰ組均為陰性，Ⅱ組分別有1/5、2/5鼠為陽性，其余為可疑；Ⅲ組分別有3/5、2/5為可疑，其余為陽性。于接種后第35天和第45天，Ⅰ組為陰性（圖1），Ⅱ組分別有3/5、5/5為陽性，其余為可疑；Ⅲ組接種后第35天有1/5鼠為可疑，其余為陽性。

2.2 胃組織勻漿細菌分離培養結果

接種Hp第7天，3組均未見Hp生長。第15天，Ⅱ組、Ⅲ組分別有1/5、2/5鼠Hp培養陽性。第35天和第45天，Ⅱ組分別有1/5、2/5鼠Hp培養陽性，Ⅲ組有3/5、3/5陽性。取無色透明的小菌落，用革蘭氏染色鏡檢，見粉紅色海鷗狀的幽門螺桿菌。

2.3 病理組織學變化

感染Hp第7天胃腸無明顯的病理變化，第15天胃黏膜輕微脫落，黏膜層出現炎性細胞浸潤（圖2）；第35天和第45天，胃底部有明顯的充血，固有層見有慢性炎癥、少量炎性細胞浸潤和腸化生現象（圖3），胃黏膜層見Hp（圖4）。

圖1 對照組的胃底（HE×400）

圖2 Ⅲ組胃固有層炎性細胞浸潤（HE×400）

圖3 Ⅲ組胃的腸化生現象（HE×100）

圖4 Ⅲ組胃黏膜內有Hp菌體（HE×1000）

3 討論

Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素；與胃腺癌、胃淋巴瘤關系也非常密切，WHO已將其列為一類致癌物[12,13]，Hp感染模型的研究具有重要的臨床意義。

蒙古沙土鼠（MG）是Hp感染模型的理想實驗動物。MG自然患胃炎約2%，亦未見自然感染Hp，但其胃病變與人類最為相似，可發生萎縮、潰瘍、腸化生和胃癌[14,15]，且是目前唯一單獨感染Hp能夠誘發胃癌的實驗動物[15]。但是造模周期較長，加之對其病理生理研究甚少，一定程度上限制了其應用。

Hp適應弱酸性環境（PH值為5.5-6.5），正常MG胃內pH為0.9-1.8[16]。為了提高Hp感染率，本實驗先灌服酒精破壞胃環境，口服雷尼替丁抑制胃酸分泌。王毅超等人采取三種不同的感染預處理實驗，結果發現用50%酒精處理的沙土鼠感染率最高[17]。酒精刺激與口服雷尼替丁相結合，可以產生更好的造病效果，且方法簡便、易行。

若直接用胃部勻漿進行細菌培養的方法來檢測是否感染，檢出率非常低。Hp是一種生存、生長條件都非常苛刻的細菌，對培養基及培養條件有很高的要求。當周圍環境不利于細菌的生長時，如細菌接種量過多，延長培養，暴露空氣（有氧環境）中，溫度低、培養基的pH升高等，Hp會產生變異體或不生長[18]。Hp菌落半透明，扁平、圓形，直徑約1mm，涂片Gram染色為陰性桿菌，形狀呈螺旋狀、S狀，弧形[19]。Hp初代培養不少于5天或培養1周仍無細菌生長，才能報告陰性。培養期間很容易感染霉菌，尤其濕度掌握不好的情況下更易有霉菌生長。Hp在外界環境中存活的時間非常短，易發生死亡。

從本實驗中可以看出，Hp感染需要的時間比較長。感染7天內僅有少量細菌生長，從胃內取樣進行細菌培養未見有細菌生長，病理組織學觀察只有輕微的炎癥反應；35天后胃內有多量細菌生長，細菌培養陽性率提高。Hp感染先引起機體急性胃炎，然后轉為慢性炎癥，隨著時間逐漸延長，炎癥逐漸加重。據報道，以感染5個月炎癥最為明顯，在幽門和胃小彎處可見潰瘍。病理組織學觀察在Hp診斷中具有重要的意義。根據組織學變化，可以確定感染的嚴重程度，細菌定植的部位以及菌群數量，對判斷治療效果也有重要意義。有學者認為，胃竇部一塊組織足以診斷Hp感染情況，組織學可以作為Hp診斷的金標準。

Hp定植在胃黏膜層，它是一種生長在胃黏膜表面與黏膜層之間的微需氧菌。尿激酶是Hp重要的定植因子，在體內Hp分泌尿激酶分解尿素產生的氨，可中和胃酸，這種一過性的低酸和高pH值使細菌能順利穿過胃黏膜到達近中性的黏膜表層定植。氨和水化合生成的羥基有細胞毒作用，氨離子會干擾胃黏膜的正常氫離子反滲，導致組織損傷，黏膜脫落。Hp感染致胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡失衡，隨著病程的進一步發展，可引起腸上皮化生現象。

Hp的染色方法很多，各有其優缺點。不同方法制備的蘇木精可使細菌的著色深淺不一，一般HE染色Hp著色淺、淡，在細菌量多時較易辨認；在細菌量少時，因細菌形態不夠清楚，不易辨認，但是HE染色仍是一種簡便的Hp檢查方法，有一定的應用價值。HE染色診斷Hp的總體準確性為92%。Warthin-Starry銀染色診斷Hp的總體準確性為95%，胃黏膜背景細胞質呈棕黃色，胞核棕褐色，Hp呈黃色，銀在細菌表面沉積使菌體增大，反差大，對比度強，易于辨認，但是此染色法操作繁瑣，技術要求高，染色時間長，試劑價格高。

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Establishment of Helicobacter Pylori Infection Model in Mongolian Gerbils

XIE Xian-sheng1,2,LIU Meng1,WANG Xiao-bo1,LI Jian-ji1,PENG Da-xin1
（1.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou Jiangsu 225009,China;2.Nat Wat spec Gen Pool,Jiangsu Animal Husbandry and Vetorinary College,Taizhou Jiangsu 225300,China）

Two methods were used to establish models of Helicobacter pylori（NCTC11637）infection in the Mongolian gerbil stomach..The methodⅠwas that the Mongolian gerbils were forbidden to eat for18hours,then feed 0.5mL of 50%alcohol and inoculated Helicobacter pylori three times at a 6h-,12h-,and 24h-interval.The methodⅡwas that it was treateDAs same as the above method,but taken Ranitidine orally everyday，with 5mg/kGBody weight.On the 7th,15th,35th,and the 45th day after inoculation,the infection and pathological changes in gastric mucosa were observed by Hp antigen diagnostic ELISA kit,bacterial culture,and histological section.The results showed that there were much Helicobacter pylori in the stomach in 35days after artificial inoculated Helicobacter pylori,combining the gastric mucous membrane damaged by alcohol with Ranitidine by oral administration per day,and the pathological changes were the same with that in natural infected cases.

helicobacter pylori;infections;mongolian gerbi;disease mode

Q93

B

1671-0142（2011）03-0078-04

謝獻勝（1961-），男，江蘇泰興人，研究員博士，研究方向為胃內幽門螺桿菌感染模型制作與胃炎防治.

“抗幽門螺桿菌高免蛋的研制”，泰州市科技開發項目（TL200519）.

（責任編輯劉 紅）