小細胞肺癌細胞系H446腫瘤細胞球培養方法的優化*

王正巖 仇曉菲 李巖磊 苗亞靜 欒雅靜

小細胞肺癌細胞系H446腫瘤細胞球培養方法的優化*

王正巖 仇曉菲△李巖磊 苗亞靜 欒雅靜

目的：探討優化體外培養小細胞肺癌細胞株H446腫瘤細胞球的方法。方法利用干細胞無血清培養技術，觀察H446細胞在下述不同培養條件下腫瘤細胞球的生長情況，并接種于超低吸附及非超低吸附培養板，調整細胞密度至1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL和1×107/mL，采用針頭吹打法和移液器吹打法將腫瘤細胞球制成單細胞懸液用以進一步傳代。結果（1）超低吸附培養板第2天形成明顯腫瘤細胞球，非超低吸附培養板第10天出現腫瘤細胞球。（2）1×106/mL組每個高倍視野下約有7個腫瘤細胞球，每個細胞球約由幾十個甚至上百個細胞組成。（3）針頭吹打法傳代后腫瘤細胞球活性和增殖能力明顯優于移液器吹打法。結論選擇超低吸附培養板、1×106/mL密度接種和針頭吹打法可有效分離腫瘤細胞球。

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腫瘤干細胞具有不斷自我更新和無限分化潛能，是腫瘤復發、轉移及耐藥的根源。腫瘤干細胞可在無血清培養條件下經表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等多種細胞生長因子誘導形成懸浮生長的細胞團塊，稱為球體(spheres)[1]。目前有關小細胞肺癌體外干細胞培養的研究較少。體外腫瘤細胞球培養條件比較嚴格，每個環節都可能影響腫瘤細胞球的形成及增殖。本實驗探索了小細胞肺癌干細胞球的培養技術，并選用不同培養板、不同接種密度和不同吹打方法進行優化比較，為研究小細胞肺癌干細胞生物學特征提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 人小細胞肺癌細胞系H446購自美國典型培養物保藏中心（ATCC），DMEM/F12（1∶1）培養基購自Gibco公司，RPMI-1640培養基購自天津潤泰科技發展有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自HyClone公司,甲基纖維素（methyl cellulose，MC）購自Sigma公司，EGF和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自PeproTech公司，B27購自Gibco公司,聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯（poly 2-hydroxyethyl methacrylate，polyHEMA）購自Sigma公司，24孔板購自天津潤泰科技發展有限公司。

1.2培養方法 （1）細胞培養：將H446細胞用RPMI-1640培養液培養，內含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L，置37 ℃，5%CO2環境下培養，備用。（2）無血清培養：無血清培養基（serum-free medium，SFM）由不含血清的DMEM/F12培養基，并添加20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、2%B27及0.7%甲基纖維素組成。甲基纖維素用去離子水配成20 g/L濃度溶液，使用前用2倍的DMEM/F12培養液稀釋制成0.7%甲基纖維素溶液。選取對數生長期的H446細胞，用PBS液清洗，胰酶消化，重懸于SFM中并將細胞調整至1×106/mL，接種于24孔板中培養。細胞培養過程中，早期采用分孔半量補液，即將24孔板中一孔腫瘤細胞懸液的半量體積分置于另一孔，再將兩孔分別補足標準量培養基。當后期細胞球數量增多和體積變大時，低速（800 r/min）離心換液。

1.3實驗方法 為有效獲得大量腫瘤細胞球，本實驗在以下3個方面進行進一步比較。（1）不同培養板實驗：為了解不同培養板對腫瘤細胞球增殖情況的影響，設立超低吸附培養板組和非超低吸附培養板組，均按上述無血清培養方法進行培養并觀察比較。其中，超低吸附培養板為常規24孔板用溶解在無水乙醇中的10 g/L poly HEMA溶液鋪2次，在超凈工作臺中風干24 h備用。非超低吸附培養板即為未鋪poly HE?MA的常規24孔板。（2）不同接種密度實驗：為了解不同接種密度對腫瘤細胞球增殖情況的影響，設立1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL及1×107/mL 4個接種密度組，均接種于超低吸附培養板內，按上述無血清培養方法進行培養并觀察比較。（3）不同吹打方法實驗：為比較不同吹打方法對腫瘤細胞球增殖情況的影響，分別用1 000 μL移液器吹打法和5號針頭吹打法2種方法將細胞球吹打成單細胞懸液。再用上述無血清培養方法接種于超低吸附培養板內，接種3 d,待培養孔中懸浮的腫瘤細胞球形狀規則、體積較大后，吸取含有細胞球的培養液，800 r/min離心3 min，棄上清，用移液器或帶5號針頭的無菌注射器重新吹打成單細胞懸液，按1∶2的比例傳代。在以上3組實驗中，均每天于倒置顯微鏡下觀察腫瘤細胞球數量、大小和細胞折光度等指標，并進行腫瘤細胞球計數：每孔內隨機取5個200倍視野分別計數，取其平均值記為此孔的腫瘤細胞球數量。

2 結果

2.1不同類型培養板對腫瘤細胞球形成及增殖的影響 采用超低吸附培養板，接種細胞24 h后，腫瘤細胞球形成，平均每個視野有8個細胞球，大小不一，每個細胞球所含細胞數達數十個至上百個，呈圓形、卵圓形或桑葚狀，懸浮生長，折光性好，細胞之間連接緊密，見圖1A；采用非超低吸附培養板，接種細胞48 h后大部分細胞貼壁呈梭形生長，少部分細胞呈懸浮狀態生長，培養至第10天有腫瘤細胞球形成，平均每個視野有3個細胞球，每個細胞球約由10個細胞構成，見圖1B。

2.2不同接種密度對腫瘤細胞球形成及增殖的影響 按1×104/mL和1×105/mL密度接種，第3天觀察有腫瘤細胞球形成，數量較少，平均每個視野有3個球體，直徑較小，大約由4～5個細胞組成，見圖1C；按1×106/mL密度接種，第2天即有明顯腫瘤細胞球形成，平均每個視野有7個球體，細胞球體積大小不一，每個球體所含細胞數有幾十個甚至上百個，細胞球致密均一，折光性良好，呈懸浮生長，見圖1D；按1×107/mL密度接種，第2天有細胞球形成，平均每個視野有5個球體，每個細胞球約由幾十個細胞形成，細胞球懸浮生長，但貼壁分化生長細胞較多，且出現數個較大的連接松散的黏附細胞團。

2.3不同吹打方法對亞代腫瘤細胞球形成的影響 采用針頭吹打法，細胞球能很好地分散開，形成單細胞和部分小細胞球。傳代后第3天亞代腫瘤細胞球出現，平均每個視野有8個球體，每個細胞球約由40個細胞組成，細胞球折光性良好，連接緊密，以圓形居多，與原代細胞球無明顯差別；采用移液器吹打法，細胞球不能很好地分散開，形成少部分單細胞和較多大細胞球，傳代后第3天腫瘤細胞球折光性差，中央有細胞死亡，平均每個視野有4個細胞球，每個細胞球約由20個細胞組成。

3 討論

目前關于肺癌腫瘤干細胞的無血清培養技術仍存在爭議。長期研究發現，含EGF和bFGF的無血清培養基有利于正常干細胞體外擴增[2]。Eramo等[3]在含EGF和bFGF的無血清DMEM/F12培養基內富集了肺癌干細胞球。Levina等[4]將非小細胞肺癌細胞H460和A549細胞在含EGF、bFGF和胰島素的0.8%甲基纖維素培養基內培養，獲得了大量富含腫瘤干細胞的細胞球。Bertolini等[5]用含EGF、bFGF和B27的無血清培養基培養得到了肺癌干細胞球。本實驗在無血清培養基內添加了EGF、bFGF和B27添加劑，并且有效地分離了腫瘤細胞球?？紤]原因為EGF和bFGF促進了細胞有絲分裂和抑制細胞分化，B27作為血清替代物，既保留了細胞賴以生存的必需營養物質，如胰島素和轉鐵蛋白，又去除了血清中的促分化劑。

惡性上皮腫瘤呈貼壁生長，一旦阻止其貼壁，癌細胞便迅速凋亡，這種細胞凋亡方式稱為anoikis[6]。腫瘤干細胞具有anoikis抗性，在無血清培養條件下，經EGF和FGF等細胞生長因子誘導，干細胞可以形成懸浮生長的細胞球體。為了提高細胞球的形成率，本實驗采用低黏附物質polyHEMA鋪板制備超低吸附培養板。與非超低吸附培養板相比較，不僅腫瘤細胞球出現較早，而且細胞球數量多且體積大，考慮原因可能為超低吸附培養板促使分化的細胞因不能貼壁生長而加快了凋亡。本實驗還采用半固體甲基纖維素培養基，進一步誘導細胞凋亡而有效促進了單細胞克隆球的形成。

腫瘤干細胞增殖所具備的條件包括細胞分裂模式、細胞周期、細胞信號和微環境。細胞自分泌或旁分泌的分泌因子和細胞間的相互作用是維持微環境的重要因素。本研究結果表明，1×106/mL的細胞接種密度是促進腫瘤細胞球增殖的最佳密度；1×104/mL和1×105/mL的接種密度中，細胞多保持單細胞狀態，細胞增殖速度較慢，考慮原因可能是培養體系中腫瘤干細胞絕對數量小，能進行對稱分裂增殖的細胞數量少，且細胞間自分泌和旁分泌所形成的分泌因子作用薄弱，致使細胞不能大量增殖；而1×107/mL接種密度下，出現大量細胞貼壁和細胞黏附成團現象，并且早期大量細胞死亡。以上結果提示，接種密度過大易使細胞重聚成團致中心細胞死亡，貼壁細胞的分化又進一步促進了重聚細胞團的分化，導致腫瘤干細胞成球效率并不能提高。在腫瘤細胞球培養的換液過程中，本實驗早期采用分孔半量補液方法，待后期細胞球數量增多和體積變大時過渡到離心換液，既保留部分原來的微環境，又避免早期離心對細胞的損害，有效地增加了腫瘤細胞球的數量。在腫瘤細胞球培養的傳代過程中，本實驗采用針頭吹打法效果優于移液器吹打法。由于細胞增殖形成的腫瘤細胞球結合非常緊密，用1 000 μL移液器吹打時不能將細胞球有效分散，導致中央細胞因營養滲透障礙而發生凋亡現象；使用針頭吹打法，細胞球能較好地分散開，形成單細胞和少量小細胞球，其亞代克隆具有很強的增殖和傳代能力，故傳代時針頭吹打法制備單細胞懸液是較好選擇。但是在采用針頭吹打法時應掌握好吹打力度及次數，盡量輕柔，避免產生氣泡，不可無限增加吹打次數，吹打的次數保持5次左右較好，以形成大量單細胞和少量小細胞球的懸液即可。

綜上，為有效獲得腫瘤細胞球，使用甲基纖維素培養基和超低吸附培養板是必要的，1×106/mL是最佳接種密度，傳代時制備單細胞懸液采用針頭吹打法較好。

[1] Mimeault M,Hauke R，Mehta PP，et a1.Recent advances in cancer stem/progei-tor cell research:therapeutic implications for overcom?ing resistance to the most aggressive cancers[J].J Cell Mol Med,2007,11(5):981-1011．

[2] Martens DJ,Tropepe V,van der Kooy D.Proliferation kinetics of fi?broblast gro-wth factor-responsive and epidermal growth factor-re?sponsive neural stem cells within the embryonic forebrain germinal zone[J].J Neurosci,2000,20(3):1085-1095．

[3] Eramo A,Lotti F,Sette G,et al.Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population[J].Cell Death Differ,2008,15(3):504-514.

[4] Levina V,Marrangoni A,Wang T,et al．Elimination of human lung cancer stem cells through targeting of the stem cell fac?tor-c-kitautocrine signaling loop[J].CancerRes,2010,70(1):338-346．

[5] Bertolini G,Roz L,Perego P,et al．Highly tumorigenic lung cancer CD133+cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(38):16281-16286.

[6] 耿沁，董強剛，姚明，等.肺癌干細胞的球體形成與致瘤性分析[J].腫瘤,2008,28(9):751-754．

Optimization of the Method to Culture Tumor Cell Spheres in Human Small Cell Lung Cancer Cell Line H446

WANG Zhengyan,QIU Xiaofei LI，Yanlei,MIAO Yajing，LUAN Yajing

Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

Objective:To optimize the method to culture the tumor cell spheres in small cell lung cancer(SCLC)cell line H446 in vitro.Methods:Using the serum-free culture technology,the growth situation of the H446 tumor cell spheres was observed in different culture conditions.The cells were inoculated to ultra low adherent plates and non-ultra low adher?ent plates.The cell density was adjusted to 1 ×104/mL,1×105/mL,1×106/mL and 1×107/mL.The cell spheres were blown in?to single cells through micropipette blow method and pinhead blow method in order for further passages.Results:（1）In ultra low adherent plates,the tumor spheres appeared clearly at the second day,while in the tenth day in non-ultra low adherent plates.（2）At the concentration of 1×106/mL,there were about seven spheres per high power field and dozens of cells even hundreds of cells for each sphere.（3）In the pinhead blow method,the tumor spheres showed better activity and proliferative ability in second generation.Conclusion:The tumor spheres can be separated effectively by ultra low adherent plate,the in?oculum density of 1×106/mL and the pinhead blow method.

lung neoplasms carcinoma,small cell cell line,tumor culture media,serum-free in vitro cell cul?ture techniques

*天津市自然科學基金資助項目（項目編號：09JCZDJC20300）作者單位：300070 天津醫科大學基礎醫學院病理教研室

△通訊作者 E-mail:qiouxf@tijmu.edu.cn

（2010-06-28收稿 2010-09-08修回）

（本文編輯 陸榮展）