普通煙草種質資源的SSR標記與指紋圖譜分析

徐 軍，劉艷華，任 民，牟建民，張興偉，陳雅瓊，王志德*

（1.農業部煙草類作物質量控制重點開放實驗室，中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

煙草在我國國民經濟中占有重要地位，煙草種質真實性和純度直接影響產品的質量，因此，種質鑒定是煙草生產和研究工作中的重要一環。傳統的鑒定方法主要有形態鑒定、蛋白及同工酶鑒定[1]，但這些方法易受實驗材料所處發育時期、取樣部位和環境等多種因素的影響，準確率不高，且實驗過程復雜，操作程序繁瑣，難以大規模推廣應用。近年來發展的分子標記技術克服了傳統方法的缺點，被越來越多地應用到種質鑒定工作中，分子標記技術種類較多，常用的有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，其中SSR標記具有結果可靠，重復性好，多態性豐富，操作簡單，呈共顯性遺傳等特點[2-3]，已被應用于水稻[4]、玉米[5]、櫻桃[6]等多種作物的種質鑒定中。

本研究利用SSR標記技術，從分子水平上鑒別區分了80份普通煙草種質，并構建了它們的SSR指紋圖譜，驗證了用SSR標記鑒別煙草種質的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究選取煙草核心種質中的 80份普通煙草種質為材料，包括14份白肋煙，9份香料煙，6份雪茄煙，26份烤煙，25份曬煙。材料均由國家煙草種質庫提供。

1.2 DNA提取

供試材料溫室育苗，長成幼苗后用CTAB法提取基因組總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測含量后保存于-20 ℃冰箱待用。

1.3 SSR檢測

實驗所用286對SSR引物序列為Bindler等[7]人公布，下載自http://solgenomics.net。PCR擴增總體 15 μL，其中包括 1×PCR 緩沖液，MgCl21 mmol/L，dNTPs各1.2 mmol/ L , Taq酶1 U，引物0.4 μmol/L ,基因組 DNA 20 ng ，PCR反應程序為：94 ℃預變性 5 min 后，94 ℃ 變性 45 s ，58 ℃ 退火 45 s ，72 ℃ 延伸45 s ，35個循環后，72 ℃再次延伸10 min，最后4 ℃保存。其中退火溫度要根據引物的不同而調整。

1.4 電泳及染色

PCR產物用 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，以1×TBE作緩沖液，180 V恒壓進行電泳。電泳后，銀染，拍照。銀染方法如下：

卸板后漂洗；然后在染色液（1 L水中溶解2 g硝酸銀，5 mL冰乙酸，100 mL無水乙醇）中染色10 min；再次漂洗后放入顯色液（1 L水中溶解15 g氫氧化鈉，3 mL 37 %甲醛）中顯色。

2 結 果

2.1 SSR多態性分析

通過對286對SSR特異性引物進行篩選，從中選出8對反應穩定，擴增條帶清晰，多態性強的引物，對這80份材料DNA進行擴增（圖1），共得到85個等位位點，其中引物 PT20189、PT20287、PT30380、PT30403的等位位點數最少，為9個；引物 PT20372、PT20213的等位位點最多，為 14個，平均為10.6個（圖2）。通過POPGENE軟件分析可知8個引物等位位點多態性信息含量 ( P I C)變幅為0.63～0.88，平均為0.81（表1）。

2.2 SSR指紋圖譜構建

以“1”和“0”分別表示擴增產物的“有”和“無”，將 8對SSR引物產生的 85 個多態位點依次排序，形成一個 SSR數據矩陣（表2），建立品種計算機化的 DNA 指紋，以區分供試的每個品種。對SSR數據矩陣聚類分析，發現這8對引物可完全將這80份煙草種質區分開來（圖3），每一份種質都有自己獨特的指紋圖譜（圖4）。

圖1 引物PT30380對部分材料擴增結果Fig.1 The amplified result of part of materials by primer PT30380

圖2 引物PT20202擴增的多態性條帶Fig.2 The polymorphic bands amplified by primer PT20202

表1 8對SSR引物名稱, PIC值, 檢測到的等位位點數目Table 1 The name of 8 pairs of SSR primer, PIC of primers and the number of the variance allele

表2 部分材料對引物PT20189和PT20287的擴增結果Table 2 The PCR results of some materials by primer PT20189 and PT20287

圖3 80份煙草種質基于SSR分析的UPGMA聚類圖Fig.3 Dendrogram derived from UPGMA cluster analysis based on SSR analysis method among 80 tobacco germplasms

圖4 485號材料對8對引物擴增的指紋圖譜Fig.4 The DNA fingerprint of material NO.485 amplified by 8 primers

3 討 論

目前用分子標記鑒定煙草種質的研究還較少，RAPD技術有過報道[8-10]，但RAPD標記的重復性和穩定性一直存在爭議，需要嚴格控制反應條件才能得到理想結果[9]，且擴增位點多態性不如SSR 標記豐富。如Coussirat J C[11]用160 對引物對32份煙草種質進行了RAPD分析，其中9對引物擴增出了29個多態性位點，平均每對引物3.2個。許明輝等[9]利用235對引物對23份煙草種質進行RAPD分析，其中16對引物擴增出46個多態性位點，平均每個引物2.9個。SSR引物在煙草上的發展和其他作物相比較晚，直到 2007年，Bindler等[7]首次報道了煙草的微衛星標記遺傳圖譜，因此，SSR在煙草研究上應用還不廣泛。本實驗中，從286對SSR引物中篩選的8對引物共擴增出85個多態性位點，平均每對引物10.6個，多態性明顯優于RAPD引物，這與劉冠明等[12]的研究結果一致。這幾對引物的重復性驗證結果也表明 SSR標記的重復性和穩定性很好。此外，實驗中還發現SSR標記對反應條件要求不嚴格，如反應對DNA模板質量要求不高，略微改變反應體系不會對 PCR反應結果造成明顯影響，與朱英等[13]的報道也相符合。因此，與RAPD標記相比，SSR標記更適合于普通煙草種質鑒定和指紋圖譜構建工作，SSR標記將會在煙草種質鑒定工作中發揮更加重要的作用。

[1]梁明山，劉煜，周翔.蛋白質電泳指紋圖譜對煙草品種鑒定的研究[J].西南農業學報，2000，13（2）：83-88.

[2]陳學偉，李仕貴，馬玉清，等.水稻抗稻瘟病基因的聚合及分子標記選擇[J].生物工程學報，2004，20（5）：708-714.

[3]WUY, HUANGY.An SSR genetic map of Moench and its comparison to a published genetic map[J].Genome,2007, 50: 84-89.

[4]張彥，郭士偉，何冰，等.利用 SSR 標記建立雜交水稻分子指紋圖譜數據庫[J].江蘇農業學報，2006，22（2）：181-183.

[5]王鳳格，趙久然，郭景倫，等.中國玉米新品種 DNA 指紋庫建立系列研究玉米品種純度及真偽鑒定中 SSR技術標準實驗體系的建立[J].玉米科學，2003（1）：3-6.

[6]艾呈祥，張力思，魏海蓉，等.甜櫻桃品種 SSR指紋圖譜數據庫的建立[J].中國農學通報，2007，23（5）：55-58.

[7]Bindler G, vander Hoeven R, Gunduz I, et al .A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J].Theo Appl Genet., 2007, 114: 341-349.

[8]梁明山，劉煜，侯留記，等.煙草品種的DNA指紋圖譜和品種鑒定[J].煙草科技，2001（1）：34-37.

[9]許明輝，鄭民憊，劉彥中，等.煙草品種 RAPD 分子標記多態性與品種鑒定[J].種子，1998（5）：23-25.

[10]何川生，張漢堯，盧江平，等.RAPD技術在烤煙品種資源鑒定及純度分析中的應用[J].河南農業大學學報，2000，34（3）：240-243.

[11]COSSIRAT J C.Genetic diversity and varietal indentification in the species Nicotiana tabacum by RAPD markers[J].Annaesddll Tabac,1994, 26: 1-7

[12]劉冠明，鄭奕雄，黎國良，等.20個花生品種的 SSR標記指紋圖譜構建[J].農業生物技術科學，2006，22（6）：49-51.

[13]朱英，陶剛，劉作易，等.SSR分子標記的發展及其在動植物遺傳育種中的應用[J].貴州農業科學，2006，34（增）：93-95.