同科植物SSR引物在煙草遺傳差異分析中的應用研究

聶 瓊，劉仁祥

（貴州大學煙草科學研究中心，貴陽 550025）

分子標記為研究作物遺傳多樣性及其品種改良提供了新的手段。在作物分子標記及其應用研究中，目前主要有RFLP、RAPD、SSR、SRAP、ISSR和AFLP標記等，這些都有效提高了作物遺傳分析的效率和準確性。SSR是指由幾個（多為2～4個）堿基組成的串聯重復的 DNA序列，如(CA)n，(ATG)n， (TAGG)n等重復。其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置。不同遺傳材料重復次數的可變性導致了SSR長度的高度變異性。由于其操作簡單、多態含量豐富、遺傳信息量大、共顯性及檢測方便等特點，被認為是一種理想的遺傳標記，已廣泛應用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位和分子標記輔助育種等研究領域。目前，在水稻、玉米、番茄、小麥、擬南芥、辣椒等植物中應用較多。煙草是一種重要的經濟作物，也在科學研究中廣泛應用，但是SSR標記在煙草上的應用，國內外報道較少。這是因為SSR標記技術應用的前提是特異物種的SSR引物的設計開發，其開發有一定難度，費用也較高，因此限制了SSR標記在煙草遺傳分析上的發展。針對煙草的SSR標記引物開發工作，直到2007年初，Bindler等進行了首次報道[1]，目前國內此類報道還較少。

本研究將同科植物的SSR引物應用于煙草，同時對其在煙草品種資源中的應用進行探討，這對于加速煙草種質資源遺傳多樣性的研究利用、豐富其分子標記類型與繪制遺傳圖譜具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

用于篩選引物的煙草材料14份（表1），包括烤煙、雪茄煙、白肋煙、曬晾煙、香料煙和野生種。用于遺傳多樣性分析的烤煙品種（系）24份（表2）。

表1 供試材料Table1 The test materials

1.2 方法

1.2.1 煙草基因組 DNA 提取 采用 CTAB 高鹽沉淀法[2]。

1.2.2 SSR標記分析 擴增反應在 Eppendorf-PC5331型PCR儀上進行，采用10 μL體系進行擴增，其中含10 ng模板DNA，2×Taq PCR MasterMix 5 μL（北京 TIANGEN），引物濃度為 0.5 μmol/L。擴增程序為：預變性94 ℃ 4 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s（退火溫度根據引物調整），72 ℃延伸1 min，共35個循環，最終72 ℃ 延伸7 min。SSR引物序列（表3）選自文獻[3-4]，由上海生物工程有限公司合成。擴增產物經10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測。

1.2.3 數據處理 SSR 擴增帶形以0和1統計，建立數據庫。在相同遷移率位置上，有帶記為 1，無帶記為0。計算引物多態信息量（PIC），PIC= 1-ΣPi2，Pi表示第i個等位位點出現的頻率。按Nei等（1979）的方法[5]計算任意兩個品種的相似系數（GS）：GS=2Nij(Ni+Nj)，其中，Ni和 Nj分別為 i和j兩份材料總的等位基因數，Nij為i和j兩材料的共有等位基因數，遺傳相異系數（GD）=1-GS，利用DPS 軟件，采用GD值按不加權成對群算數平均法（UPGMA）進行聚類分析，構建分子進化系統樹狀圖。

2 結 果

2.1 引物篩選

選取 5個類型 14個遺傳差異大的煙草材料DNA為模板，從22對SSR引物中篩選到多態性、重復性、穩定性都較好的8對引物，引物多態性見表4。其中9號引物的電泳譜帶清晰可見，且不同品種的條帶不同，多態性為 100%（圖1）。8對引物共檢測到72條譜帶，60條遺傳多態性帶，多態性條帶數比率達83.33%，擴增片斷長度為80～500 bp，每對引物擴增的多態性帶數目為4～14個，平均7.5條；引物多態信息量變化范圍為0.714～1，平均 0.811。這表明，這些引物在檢測煙草基因組遺傳多態性上有較顯著的檢出效率，可以用于煙草SSR圖譜的檢測，并可進行煙草遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構建。

表2 供試材料編號、 名稱及來源Table2 Code, name and origins of tobacco germplasms

表3 SSR 引物編號、序列及來源Table3 SSR primers’ codes, sequences and origins

2.2 SSR引物對烤煙品種（系）遺傳多態性分析

應用篩選出的8對引物對24份烤煙品種（系）進行SSR擴增，8對引物共檢測到98個位點，其中 66個具有遺傳多態性，每對引物擴增的多態性帶數目為5～16個，平均8.2個，引物多態信息量變化范圍為 0.451～1，平均 0.646。擴增片斷長度為50～560 bp。24個煙草材料的DNA譜帶表現出較好的遺傳多態性，圖2是引物9對24個烤煙材料的SSR圖譜，譜帶可把24個品種完全區分開，表現出100%的多態性。

表4 多態性引物Table4 The primers which produced polymorphic bands

圖1 14個煙草材料DNA-SSR 指紋圖譜。1-14：引物9的擴增圖譜；16-29：引物14的擴增圖譜；M：MarkerFig.1 Result of PCR amplification using primers 9 and 14

圖2 引物9 對24 份煙草材料的SSR 擴增圖譜。M：Marker，1～24為材料編號，其對應的品種名稱同表2Fig.2 SSR patterns of 24 tobacco amplified by primer 9

2.3 品種（系）間親緣關系和聚類分析

根據8對引物的SSR圖譜，建立0-1數據庫，計算24個供試材料樣本間的遺傳相異系數（GD）。結果表明，遺傳相異系數變異范圍為 0.3445～0.8626，平均 0.6052，其中紅花大金元和威寧白花煙的遺傳相異系數最小，僅為0.3445，表明兩者的親緣關系最近。NC82和韭菜坪2號之間的遺傳相異系數最大（0.8626），表明它們相互之間的遺傳基礎相對較遠。整體來看，引進品種的遺傳相異系數0.6057略低于貴州選育品種（系）0.6236，表明我省地方材料品種的遺傳差異較大。本中心自選品系GDH系列的遺傳相異系數較近，為0.5640。在所有供試材料中，Va116與其他品種的遺傳相異系數最高，遺傳相異系數在0.484～0.717之間，說明此品種與其他供試材料間遺傳基礎相對較大，遺傳相似性最低。

利用SSR遺傳距離矩陣按UPGMA方法構建了各個供試品種的樹狀聚類圖（圖3）。聚類結果與品種間的親緣關系具有較好的一致性：在遺傳距離為0.63水平時，可將24個品種聚為4個類群，大部分美國引進品種和本中心自育的品系都在第Ⅰ類；Coker147和Va116獨自成第Ⅱ和第Ⅳ類；貴州自育或地方品種及云煙 317，NC27NF等部分引進品種歸為第Ⅲ類。在遺傳距離為0.54水平時，第Ⅰ類又可分為3個亞類，第Ⅰ亞類包括G70、GDH黃葉突變體、RG11、G80、C1-5-1、GDH84、GDH64，其中本中心自育的品系GDH84、GDH64、GDH黃葉突變體和G70、G80都有G28的血統，因此聚為一類。NC82自成第Ⅱ亞類，第Ⅲ亞類包括GDH02、K326、8611、GDH279、水城煙、K730，其中 GDH02、GDH279都具有8611的血統，而8611是中國農業科學院煙草研究所用（單育2號×G-28）×（G-28×凈葉黃）雜交育成的，也是G28的后代。第Ⅲ類又分為4個亞類。GDH88，NC27NF各自成為第Ⅰ亞類和第Ⅳ亞類，第Ⅱ亞類包括紅花大金元、威寧白花煙、南江3號、G140，其中南江3號是從紅花大金元品種中獲得的自然變異株，經系統選擇培育而成。第Ⅲ亞類包括韭菜坪2號和云煙317。系譜分析表明，多數品種的親緣關系與聚類結果基本一致，少數不一致，這可能與其長期定向栽培選育過程中產生變異有關。

3 討 論

圖3 24 份煙草材料基于SSR 標記的聚類圖Fig.3 Clustering of 24 tobacco materials based on SSR

一些研究人員早已證明一個物種的微衛星引物可以在研究其近源植物中被利用[5-6]。筆者運用番茄、辣椒的SSR引物對24份在煙草育種中貢獻較大的種質進行SSR擴增分析，結果表明遺傳相異系數變異范圍在0.3445～0.8626之間，平均0.6052，說明這些品種（系）之間的遺傳背景較遠。聚類分析結果也從分子水平進一步驗證了我國煙草育種資源的匱乏，主要使用的主體親本是 K326、紅花大金元和 G28。梁景霞[8]、肖炳光[9]、陶愛芬等[10]分別運用ISSR、RAPD、AFLP、SRAP、SSR等標記對現有主要育成品種和栽培煙草品種的遺傳多樣性及系譜親緣關系進行了分析，發現品種之間的遺傳背景相似，親緣關系較近，特別是烤煙品種之間存在著遺傳基礎狹窄的問題。與前人的研究結果相比，筆者發現本研究的這些烤煙品種（系）間的親緣關系較遠，這與這些材料是本中心雜交育種中貢獻較大有關，作為雜交育種親本，差異一般都較大。

研究還表明我省選育品種和地方材料的遺傳差異大于引進品種。貴州省屬山區氣候特點，生態環境差異比較大，栽培選育的煙草品種之間的差異也較大，這有利于我省煙草品種資源的利用與發展。筆者認為結合煙區生態條件，充分發揮貴州煙葉生產地區生態環境差異大的優勢，加強對現有特色品種的改良，在突出地方特色品種風格的基礎上，提高綜合性狀，可培育一批具有鮮明地方特色的新品種。

4 結 論

本實驗的結果與實際材料的親緣關系基本一致，并揭示了不同品種的遺傳基礎，表明同科植物的SSR引物可對煙草種質資源進行遺傳差異分析，而且也可為煙草品種的鑒定、遺傳分析和核心種質的構建提供可靠信息，有著潛在的應用價值。

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