煙草SSR熒光標(biāo)記與毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)研究

陳雅瓊，李鳳霞，李錫坤，徐 軍，張 磊，王紹美，孫玉合*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 10081）

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是生物技術(shù)研究的模式植物之一。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，利用DNA分子標(biāo)記開(kāi)展煙草的遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究取得了一定進(jìn)展[1]。最初多采用RAPD標(biāo)記[2]，但是該方法存在著多態(tài)性低和穩(wěn)定性差的問(wèn)題，其應(yīng)用受到了一定的限制。此外還有研究者采用AFLP和ISSR標(biāo)記方法[3-4]。在基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記中，simple sequence repeats（SSR，又稱(chēng)微衛(wèi)星microsatellites）分子標(biāo)記技術(shù)由于其具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、有高度變異、微衛(wèi)星在染色體上分布均勻等諸多優(yōu)點(diǎn)[5-8]，已成為研究煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性與基因組作圖的首選標(biāo)記。與其他植物相比，煙草 SSR標(biāo)記研究起步相對(duì)較晚。直到2007年，Bindler等[9]首次報(bào)道了煙草的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳圖譜，總共282個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增的293個(gè)SSR位點(diǎn)被定位到煙草24個(gè)連鎖群上。

傳統(tǒng)的 SSR操作通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳配合其他一些生物技術(shù)來(lái)進(jìn)行基因的多態(tài)性分析，方法雖然成熟但耗時(shí)、耗力、非自動(dòng)化，在大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析時(shí)仍存在相當(dāng)大的難度，主要體現(xiàn)在不同等位變異難以準(zhǔn)確識(shí)別、不同批次反應(yīng)數(shù)據(jù)難以統(tǒng)一處理等[10]。另外一種可以用來(lái)進(jìn)行基因多態(tài)性分析的手段為高效液相色譜法，但由于它的分辨率較低和成本較高而缺乏應(yīng)用前景。因此，大規(guī)模的SSR研究迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、高效率的檢測(cè)方法。

熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)因具有高效、自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，在大麥[11]、黑麥草[12]、萵苣[13]、竹子[14]等多種植物分子標(biāo)記研究中顯示出極為廣闊的應(yīng)用前景。該法使用三引物擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)，采用D2、D3和D4三種不同顏色的熒光染料標(biāo)記微衛(wèi)星引物，將不同熒光標(biāo)記、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度差異較大的PCR 產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分子量樣品（內(nèi)標(biāo)）在同一泳道中進(jìn)行電泳。通過(guò)毛細(xì)管電泳，將結(jié)果自動(dòng)記錄在計(jì)算機(jī)上，利用 CEQ片段分析軟件進(jìn)行圖像收集和分析，精確計(jì)算出微衛(wèi)星等位變異擴(kuò)增片段的大小，實(shí)現(xiàn)了 SSR 標(biāo)記與高效、自動(dòng)化技術(shù)的結(jié)合[15]。李鳳霞等[16]應(yīng)用類(lèi)似的技術(shù)，對(duì)煙草屬內(nèi)4種類(lèi)型的5份栽培煙草以及28份煙草野生種進(jìn)行了熒光AFLP分析，鑒定了它們的親緣進(jìn)化關(guān)系，在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)其他相關(guān)的報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)9份煙草材料的SSR位點(diǎn)進(jìn)行熒光檢測(cè)分析，建立并優(yōu)化毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于煙草SSR分子標(biāo)記研究的技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化煙草遺傳多樣性研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

9份有代表性的材料選自農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因煙草環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（青島）（表 1）。采集營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的葉片，經(jīng)液氮速凍后于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 煙草基因組 DNA 提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京），按說(shuō)明書(shū)分離煙草葉片的總DNA，紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè) DNA質(zhì)量及濃度。稀釋至 30～50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR反應(yīng)體系總體積為15 μL，其中模板 DNA（30～50 ng/μL）1.5 μL，10×reaction buffer（KCl）1.2 μL，Mg2＋（25 mmol/L）0.8 μL，dNTP（25 mmol/L）1.2 μL，TagDNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μL，SSR 反向引物（10 μmol/L）1.2 μL，適當(dāng)摩爾比例帶有M13尾巴序列的特異正向引物10 μmol/L及熒光標(biāo)記的通用型M13引物16 μmol/L 共 1.2 μL，ddH2O 7.7 μL。在保持其他因素一致的條件下，改變特異正向引物與M13引物的比例，篩選最優(yōu)比例。PCR反應(yīng)中采用的引物是從已公布的煙草 286對(duì) SSR多態(tài)性引物中篩選出來(lái)的PT20202（表2），其擴(kuò)增帶型清晰、多態(tài)性高、重復(fù)穩(wěn)定性好。其余試劑購(gòu)自TaKaRa。

采用ABI Applied Biosystem PCR儀進(jìn)行 PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。其中，引物PT20202退火溫度經(jīng)溫度梯度擴(kuò)增篩選所得。

1.2.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3 μL 6×Loading buffer（36%甘油；0.035% 二甲苯胺藍(lán)；30mmol/L EDTA；0.05%溴酚藍(lán)），在 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒電壓180 v電泳75 min左右。采用優(yōu)化的快速銀染法：0.1%的硝酸銀染12 min，去離子水漂洗20 s，顯影液（10 g NaOH，0.2 g Na2CO3溶于500 mL水中）顯色10 min，用去離子水漂洗2遍。

表1 供試材料及類(lèi)型Table1 The tested tobacco varieties

表2 SSR引物類(lèi)型及序列Table2 The types and sequences of SSR primers

1.2.4 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)檢測(cè) PCR產(chǎn)物在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)（Beckman Coulter, USA）上進(jìn)行SSR多態(tài)性分析。該系統(tǒng)采用熒光標(biāo)記、毛細(xì)管電泳分離和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)。PCR產(chǎn)物稀釋15倍，吸取稀釋后的PCR產(chǎn)物作為分析樣本加入樣品板，每孔加入適當(dāng)比例的SLS（上樣緩沖液，甲酰胺）與分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400（internal standard 400）。樣品板樣品孔內(nèi)加入半滴礦物油以防止在CEQ8000上運(yùn)行時(shí)反應(yīng)物蒸發(fā)，緩沖液板中對(duì)應(yīng)孔內(nèi)加入 3/4體積的緩沖液。選擇 HUM-STR 方法（毛細(xì)管溫度 50 ℃；進(jìn)樣 2.0 KV，30s；電泳4.8 KV，65 min）進(jìn)行電泳分析。

通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記，所得的數(shù)據(jù)被自動(dòng)收集起來(lái)，利用CEQ片段分析軟件（Beckman Coulter，USA）自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，并將有效峰轉(zhuǎn)化為“0、1”原始數(shù)據(jù)矩陣。

2 結(jié) 果

2.1 煙草SSR熒光標(biāo)記與毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)體系的建立

2.1.1 PCR反應(yīng)體系中M13引物與特異正向引物的摩爾比例（以下簡(jiǎn)寫(xiě)為M:T）的確定 為了找到M13引物與特異正向引物之間的最佳比例，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)作為對(duì)比進(jìn)行了分析。圖 1是9份煙草材料M:T分別為5:5、6:4、7:3、8:2時(shí)的擴(kuò)增效果圖。結(jié)果表明,帶有 M13尾巴的特異正向引物過(guò)多時(shí)會(huì)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)（圖1A1-9），過(guò)少時(shí)條帶較淡（圖1C 1-9及1D 1-9），且特異正向引物越少條帶越淡；而當(dāng)M:T=6:4時(shí)（圖1B1-9），擴(kuò)增條帶清晰、有明顯的多態(tài)性。因此可以確定M:T的最適摩爾比例是6:4。

圖1 M13引物與特異正向引物不同摩爾比例對(duì)擴(kuò)增效果的影響，M:T比例A為5:5，B 6:4，C 7:3，D 8:2；泳道1-9依次是9份煙草材料Fig.1 Effects of different molar ratios of M13 primer and specific forward primer on the amplification

2.1.2 上樣體系中SLS、分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400及樣本量的摩爾比例的確定 進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析時(shí)，分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400與SLS的比例一般不小于1:100。結(jié)果表明，加入 30 μL SLS，0.3 μL 分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400，應(yīng)該加入1.0 μL 稀釋后的PCR產(chǎn)物，這樣出峰有序而且無(wú)關(guān)峰較少。為降低成本，將 SLS的用量從30 μL 減少到 25 μL、20 μL、再到 15 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)的一致性和重復(fù)性較好、體系幾乎不受影響，CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性亦表現(xiàn)良好。因而可以確定，上樣體系中 SLS:分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400:樣本=300:3:10，SLS 用量為 15 μL。

2.2 煙草SSR位點(diǎn)分析

2.2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 利用引物PT20202對(duì)9份煙草材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（圖 1B1-9）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在這些煙草材料之間存在多態(tài)性，并且擴(kuò)增帶型清晰，可以用于對(duì)供試材料進(jìn)行基因組多態(tài)性分析。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，此對(duì)引物具有較好的鑒別能力，采用這種高鑒別力的引物可能用較少的引物數(shù)目就能將所有供試材料分開(kāi)。

2.2.2 毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè) 采用上述所建立的技術(shù)體系，在 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上利用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因片段。圖2為 SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)法對(duì)引物PT20202擴(kuò)增片段進(jìn)行分析的部分結(jié)果，微衛(wèi)星分析結(jié)果表明，總體信號(hào)清晰，9個(gè)DNA樣品電泳峰型各異，即每個(gè)DNA樣品具有特異的指紋圖譜，易于判斷。引物PT20202擴(kuò)增出的多態(tài)性片段長(zhǎng)度在100 bp左右，而且在1個(gè)SSR位點(diǎn)上共檢測(cè)到2個(gè)等位基因，分別是93 bp和113 bp。因此，它們可用作鑒定9個(gè)煙草材料的分子標(biāo)記。

圖2 毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)G28（A）、N.sylvestris ×N.tomentosiformis（B）、N.sylvestris（C）和K326（D）微衛(wèi)星標(biāo)記Fig.2 The microsatellite fluorescence detection graphs of G28(A), N.sylvestris ×N.tomentosiformis(B), N.sylvestris(C) and K326(D) by capillary electrophoresis

3 討 論

3.1 三引物對(duì)構(gòu)建SSR分析體系的重要性

熒光標(biāo)記引物與毛細(xì)管電泳檢測(cè)相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草SSR進(jìn)行自動(dòng)化分析。三引物的構(gòu)成是確立CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)最佳技術(shù)體系的關(guān)鍵，也是自動(dòng)化分析的前提與基礎(chǔ)。PCR反應(yīng)中所用的三種引物量的關(guān)系是：M13引物與5’端加有M13尾巴序列特異正向引物的摩爾比例通常是 1～9:1；特異正向引物與 M13引物量的加和等于普通反向引物的用量。在反應(yīng)的初始階段，帶有M13尾巴的特異正向引物和普通反向引物一起特異性地?cái)U(kuò)增微衛(wèi)星，當(dāng)特異正向引物消耗殆盡，有熒光標(biāo)記的M13引物就會(huì)代替其發(fā)揮作用，產(chǎn)生有標(biāo)記的擴(kuò)增等位基因。PCR反應(yīng)體系中M:T通過(guò)影響等位基因的擴(kuò)增效率，進(jìn)而影響 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)對(duì)SSR的多態(tài)性分析。因而，把握好體系中引物的各種比例關(guān)系是準(zhǔn)確進(jìn)行微衛(wèi)星分析必不可少的。

3.2 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)中上樣體系對(duì)構(gòu)建SSR分析體系的重要性

進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析時(shí)，上樣體系中所加SLS、分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400及樣本量均影響熒光檢測(cè)的信號(hào)。分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400與SLS的比例一般不小于1:100；所用PCR產(chǎn)物的數(shù)量取決于PCR反應(yīng)的效率以及擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)的信號(hào)強(qiáng)度，其中后者隨標(biāo)記染料種類(lèi)的變化而變化。因此，比例適當(dāng)?shù)纳蠘芋w系能夠保證微衛(wèi)星分析的順利進(jìn)行。此外，為了節(jié)約成本，在不影響檢測(cè)效果的基礎(chǔ)上應(yīng)盡量縮小上樣體系。

3.3 毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)與銀染法檢測(cè)效果比較

在利用銀染法聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，同一膠板上所有樣品帶譜間相對(duì)位置的識(shí)別以及不同膠板得到的 SSR數(shù)據(jù)的統(tǒng)一會(huì)給數(shù)據(jù)收集和分析帶來(lái)很大的困難[15]。CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)在數(shù)據(jù)收集和處理上采用 CEQ軟件分析，可以自動(dòng)讀出目標(biāo)DNA片段的大小，將峰譜轉(zhuǎn)化為0與1矩陣，進(jìn)而進(jìn)行計(jì)算機(jī)運(yùn)算，這樣不僅使工作效率大大提高，獲得比銀染法更多的全基因組變異信息，而且得到的數(shù)據(jù)也更加準(zhǔn)確。

在本研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)在其他植物遺傳分析中的應(yīng)用，大量實(shí)驗(yàn)說(shuō)明該技術(shù)較銀染法檢測(cè)效果更為理想。

3.4 多重PCR體系的建立

多重PCR技術(shù)是采用3種不同顏色的熒光染料對(duì)有相同序列的M13引物分別標(biāo)記，使通過(guò)一次毛細(xì)管電泳可以進(jìn)行3種以上不同微衛(wèi)星標(biāo)記的多重分析。這一技術(shù)體系的建立，可以有效降低成本，提高通量，使微衛(wèi)星檢測(cè)更為簡(jiǎn)單高效。在實(shí)際操作中，關(guān)鍵在于把握好通過(guò)每次毛細(xì)管電泳的等位基因片段大小要有區(qū)分。首先應(yīng)該選擇擴(kuò)增產(chǎn)物差異較大的基因標(biāo)記來(lái)組合多重PCR體系，以避免不同位點(diǎn)之間產(chǎn)生混淆。其次是依據(jù)峰圖的高低，不斷優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系，通過(guò)調(diào)整模板DNA與引物的相對(duì)用量，最終得到雜帶少、信號(hào)強(qiáng)的基因標(biāo)記。

4 結(jié) 論

本研究利用毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)分析煙草SSR多態(tài)性，建立了CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)用于煙草微衛(wèi)星分析的最佳技術(shù)體系：PCR反應(yīng)中，M:T＝6:4；進(jìn)行毛細(xì)管電泳時(shí)，PCR產(chǎn)物以15倍梯度稀釋、SLS:分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400:樣本=300:3:10；上樣體系可縮小到 SLS用量為 15 μL。將 CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)用于煙草 SSR分子標(biāo)記研究是可行的。本研究得到的2個(gè)煙草微衛(wèi)星位點(diǎn)，可用于區(qū)分煙草種群以及構(gòu)建煙草遺傳圖譜。

[1]葉蘭欽，辛明明，杜金昆，等.SSR標(biāo)記應(yīng)用于煙草品種遺傳多樣性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（1）：56-62.

[2]何川生，張漢堯，盧江平，等.RAPD技術(shù)在烤煙品種資源鑒定及純度分析中的應(yīng)用[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，34（3）：240-243.

[3]杜傳印，劉洪祥，田紀(jì)春.部分煙草種質(zhì)親緣關(guān)系的AFLP分析.作物學(xué)報(bào)[J]，2006，32（10）：1592-1596.

[4]祁建民，王濤，陳順輝，等.部分煙草種質(zhì)遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR標(biāo)記分析[J].作物學(xué)報(bào)，2006，32（3）：373-378.

[5]梁景霞，祁建民，方平平，等.煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的 ISSR聚類(lèi)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（1）：286-294.

[6]陸光遠(yuǎn)，伍曉明，張東曉，等.SSR標(biāo)記分析國(guó)家油菜區(qū)試品種的特異性和一致性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（1）：32-42.

[7]華蕾，袁筱萍，余漢勇，等.我國(guó)水稻主栽品種 SSR多樣性的比較分析[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2007，21（2）：150-154.

[8]孫友位，李明順，張德貴，等.利用SSR標(biāo)記研究85個(gè)玉米自交系的遺傳多樣性[J].玉米科學(xué)，2007，15（6）：19-26.

[9]Bindler G，van der Hoeven R，Gunduz I，et al.A microsatellite marker based linkage map of tobacco [J].Theor Appl Genet，2007，114：341-349.

[10]劉曉鑫，謝傳曉，趙琦，等.基于 SSR熒光標(biāo)記技術(shù)的玉米群體混合樣本基因頻率分析方法[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(12)：3991-3998.

[11]Castillo A，Budak H，Varshney R K，et al.Transferability and polymorphism of barley EST-SSR markers used for phylogenetic analysis in Hordeum chilense [J].BMC Plant Biol, 2008, 8: 97-105.

[12]Studer B, Asp T, Frei U, et al.Expressed sequence tag-derived microsatellite markers of perennial ryegrass(Lolium perenne L.) [J].Mol Breed, 2008, 21: 533-548.

[13]Simko I.Development of EST-SSR markers for the study of population structure in lettuce (Lactuca sativa L.) [J].J Hered, 2009, 100(2): 256-262.

[14]Sharma V, Bhardwaj P, Kumar R, et al.Identification and cross-species amplification of EST derived SSR markers in different bamboo species[J].Conserv Genet, 2009,10(3): 721-724.

[15]郝晨陽(yáng)，王蘭芬，賈繼增，等.SSR熒光標(biāo)記和銀染技術(shù)的比較分析[J].作物學(xué)報(bào)，2005，131（12）：144-149.

[16]李鳳霞，王衛(wèi)峰，王魯，等.煙草屬植物遺傳多樣性和親緣進(jìn)化關(guān)系的熒光 AFLP分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（12）：2418-2427.

[17]張振中，吳逸明，吳如金.毛細(xì)管電泳在基因突變分析中的應(yīng)用[J].藥學(xué)進(jìn)展，1997，21（4）：207-211.