熒光定量PCR技術在骨關節結核中的診斷價值

李秀武 劉建強 賈晨光 李曉霞 袁先改

熒光定量PCR技術在骨關節結核中的診斷價值

李秀武 劉建強 賈晨光 李曉霞 袁先改

目的探討熒光定量 PCR(FQ-PCR)技術對活動性骨關節結核的診斷價值。方法選擇關節炎患者 52例,應用 FQ-PCR技術檢測患者尿液中 TB-DNA的檢出率,并與抗酸染色法的檢出率比較。結果52例關節炎疾病患者中,確診結核性關節炎患者 36例,TB-DNA陽性 22例,全部確診為結核性關節炎,陽性率 61.11%,特異度 100%,抗酸染色陽性 2例,陽性率 5.56%。結論應用 FQ-PCR技術檢測結核性關節炎患者關節腔積液中 TB-DNA,具有高度敏感性和特異性,明顯優于抗酸染色法,差異有統計學意義(P＜0.01)。

實時熒光定量 PCR；結核分枝桿菌；關節炎；關節腔積液

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部病例均來自 2006年 8月至 2009年 10月在我院住院的骨關節疾病患者52例,其中男 34例,女 18例；年齡 15～77歲。

1.2 標本采集 在局麻和無菌條件下,抽取患者關節腔積液 2～5ml置于帶蓋的無菌瓶中,立即送檢,分別用 FQ-PCR技術和抗酸法檢測 TB-DNA和抗酸桿菌。

1.3 主要儀器與試劑 FQ-PCR 儀器設備為達安基因有限公司生產的 7600型實時熒光定量檢測系統,試劑盒為中山大學達安基因有限公司生產的結核分枝桿菌核酸擴增熒光試劑盒。抗酸:5%的石炭酸復紅液,5%的鹽酸酒精液,稀釋美藍。

1.4 方法 FQ-PCR:每次操作均加入質控品。

1.4.1 標本處理:取無菌留取的關節腔積液 1m l加入 1.5ml的離心管中 12 000 r/min離心 5m in,留取沉淀,加入 1m l無菌0.9%氯化鈉溶液洗滌 1次,離心、留取沉淀,加入 50μl DNA提取液混勻,100℃恒溫干浴 10min,4℃冰箱冷卻至室溫后,離心待用。

1.4.2 質控品處理:①將標準品、陰、陽性質控品 6 000～8 000 r/min離心 5 s。②取陰、陽性質控品各 50μl加等量已混勻的 DNA提取液混勻,100℃恒溫干浴 10min,4℃冰箱冷卻至室溫后,離心待用。

1.4.3 把處理過的標本,標準品,陰、陽性質控品分別吸取上清 2μl加入反應管中,8 000 r/min離心 5 s,上機,按預設程序進行擴增和分析,得出結果。抗酸法:用厚涂片法。關節腔積液 2～3ml,3 000 r/min離心 15 min,棄上清,留沉渣涂片,固定,抗酸染色,陽性為紅色。

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件,計數資料采用χ2檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

52例骨關節疾病患者中,經臨床癥狀,X線檢查,實驗室檢查,確診為骨關節結核的病例 36例,診斷符合中華醫學會臨床診治指南制定的結核病診斷標準[2]。其他原因引起感染者 16例。用 FQ-PCR法檢測關節腔積液TB-DNA陽性22例,全部為確診結核性關節炎的病例,陰性 30例,其中非結核性關節炎 16例,假陰性為 14例,特異度 100%,陽性率 61.11%。用抗酸法檢出陽性病例 2例,TB-DNA陽性患者2例,特異度100%,陽性率 5.56%,陰性 50例,假陰性 34例。FQ-PCR檢出陽性率明顯高于抗酸法(P＜0.01)。見表 1、2。

表1 FQ-PCR與抗酸法檢測關節腔積液的結果比較 n=52

表2 FQ-PCR與抗酸法檢測關節腔積液的陽性率比較 n=36

3 討論

目前對結核性關節炎的診斷一直是困擾醫務工作者的難題,由于結核性關節炎的早期,臨床癥狀不明顯,癥狀不典型,與風濕性關節炎等其他原因導致的關節炎很難區分,沒有特異性,X線檢查在發病初期不明顯,一般在 3個月左右才顯示[1],據報道,結核性變態反應型關節炎,首診100%誤認為風濕性關節炎,發病后 3個月以上還不考慮結核病的誤診率為 93%,嚴重影響患者預后[3]。實驗室檢查是診斷骨與關節結核必不可少的項目。結核病的細菌學檢查是發現病原體的主要手段,是確定結核病診斷和治療方案的重要依據,長期以來,結核病的實驗室診斷主要依據涂片抗酸染色鏡檢,結核菌培養法。涂片法的優點是:簡便、快速、價廉,送檢當天出結果。缺點是,敏感性低,特異性差,不能區分結核桿菌和非結核分枝桿菌,對 L型和顆粒型結核菌也不能檢出[4]。結核菌培養法是診斷結核病的金標準,精確可靠,特異性高,但是,所需時間長,通常 4～8周出結果,且敏感性低,嚴重影響了結核病的早期診斷和及時治療[5]。PCR定性技術自1985年問世以來由于很多技術問題如易污染,假陽性率高被叫停,而 FQ-PCR是在常規 PCR的基礎上,加入熒光標記的探針,巧妙地把核酸擴增、雜交及光譜技術結合在一起,從而實現了對目的基因的定量檢測。技術特點是在封閉狀態下檢測,避免了擴增產物污染所致的假陽性；光譜技術提高了靈敏度；熒光探針雜交進一步提高了特異性[6]。理論上,只要樣本中有一個病原菌存在,FQ-PCR就可以檢測到。該技術已成功用于檢測痰標本和肺泡灌洗液標本,特別是含菌量低的標本。如無空洞型或病變范圍較小的肺結核痰標本[7]。對肺結核的早期診斷起到了積極的作用[8,9]。

我們用熒光定量 PCR技術對結核性關節炎的關節腔積液進行檢測,并與抗酸染色法進行了比較,在 52例關節炎患者中,FQ-PCR檢測的陽性數為 22例,陰性 30例,其中,結核性關節炎 36例,非結核性關節炎 16例,陽性患者 22例,全部為確診病例,特異度 100%,陽性率為 61.11%,抗酸染色檢測陽性 2例,陰性 50例,陽性率 5.56%,2例患者均為 TB-DNA陽性患者,特異度 100%。二者特異度無區別。實時熒光定量檢出的陽性率明顯高于抗酸染色法,二者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。兩種方法均存在假陰性,FQ-PCR的檢測的假陰性數為 14例,假陰性率為 38.89%,抗酸染色檢測的假陰性數為 34例,假陰性率為 94.44%,實時熒光定量檢出的假陰性率明顯低于抗酸染色法,二者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。原因可能為關節腔積液中,結核桿菌的含量低,所檢測標本的用量少,未能取到。或者操作不當,標本的采集不當,可以通過加強培訓,做好標本的采集和保存,使臨床檢測更準確。

本研究結果表明,在骨關節結核的診斷中,漿膜腔積液細菌學檢測是一種重要的途徑,FQ-PCR技術具有敏感性,特異性強的特點,FQ-PCR技術明顯優于抗酸法,可作為結核性關節炎早期診斷的一個可靠指標。

1 謝惠安,楊國太,林善梓,等.現代結核病學.第 1版.北京:人民衛生出版社,2000.378-383.

2 中華醫學會主編.臨床診治指南(結核病分冊).第 1版.北京:人民衛生出版社,2005.64-86.

3 張敦容主編.現代結核病學.第 1版.北京:人民軍醫出版社,2000.547-548.

4 馬玙,朱莉貞,潘毓萱主編.結核病.第 1版.北京:人民衛生出版社,2006.100-105.

5 譚笑.結核病實驗室快速診斷方法的研究.湖南師范大學學報,2007,4:58-59.

6 李國釗.實時熒光定量 PCR技術及在結核病診斷實驗室的研究和應用.臨床肺科雜志,2008,13:1315-1317.

7 張江漫,李志惠,田艷茹,等.熒光定量 PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中結核菌 DNA對肺結核診斷的臨床價值.河北醫藥,2008,30:1543-1544.

8 辛茶香,劉珍瓊.熒光定量 PCR技術檢測結核分枝桿菌 DNA的應用價值.國際檢驗醫學雜志,2007,28:201.

9 韓紀勤.熒光定量聚合酶連反應診斷結核病臨床應用研究.山西醫科大學學報,2006,37:180.

R 529.2

A

1002-7386(2011)01-0073-02

項目來源:河北省醫學科學研究重點課題計劃(編號:20090260)

050041 石家莊市,河北省胸科醫院

骨與關節結核屬于肺外結核中最常見的多發慢性疾病,多繼發于肺結核,由于多種原因導致肺結核不能得到及時有效的治療,使結核桿菌蔓延,經淋巴或血行途徑而致病。由于發病遲緩,癥狀不明顯,早期診斷的難度大[1],檢出率明顯低于肺結核。嚴重影響患者的預后,致殘率高。我們用熒光定量 PCR(FQPCR)技術對骨關節結核病人的關節液進行檢測,報告如下。

2010-09-20)