2007-2008年上海市 H9N2亞型禽流感病毒的遺傳演化＊

葛菲菲,劉 健,鞠厚斌,張維誼,周錦萍

2007-2008年上海市 H9N2亞型禽流感病毒的遺傳演化＊

葛菲菲,劉 健,鞠厚斌,張維誼,周錦萍

目的 對分離自上?；钋菖l市場的11株 H9N2亞型A IV(2007年5株、2008年6株)進行了 PB2,PB1,HA,NP和NA的測序,以闡明2007年至2008年上海地區 H9N2亞型禽流感病毒分離株的遺傳變異及分子特征。方法采集雞氣管和泄殖腔樣品,將 H9亞型熒光RT-PCR試劑盒檢測的陽性樣品處理后,經雞胚尿囊腔接種分離病毒,H I進一步確定HA亞型,通過RT-PCR方法分別擴增了這11個毒株的PB2,PB1,HA,NP和NA并進行了序列測定。結果對 HA基因進行遺傳發生關系分析,這11株分離株均屬于Ck/Bei/1/94系。這11個毒株的5個片段的組成有兩種方式。結論上海活禽批發市場的11株 H9N 2亞型A IV毒株中已包含了 H5的片段,所以在今后的工作中加強 H9N2亞型禽流感流行病學監測是非常必要的。

H9N2亞型禽流感;測序;遺傳發生關系

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza,A I)引起的禽類的一種傳染病[1]。目前,根據表面糖蛋白血凝素(HA)基因和神經氨酸酶(NA)基因,A IV可以分為 16種 HA亞型和 9種 NA亞型。其中H 9N 2亞型禽流感病毒一般在雞群呈隱性感染狀態,較為明顯的癥狀是能引起輕微的呼吸道癥狀,但是影響產蛋雞的產蛋量和肉雞的增重,特別是與其他病毒和細菌混合感染時,呈協同作用,引起發病率和致死率升高[2]。研究表明,H9N2亞型禽流感病毒是我國主要的流行毒株[3]。然而,1999年被發現的 H9N2亞型A IV可突破種間屏障傳染人和豬[4]。該病毒粒子表面鑲嵌著2種重要的纖突,即血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA),它們與病毒的毒力、傳播關系密切。HA在病毒吸附及穿膜過程中起著關鍵作用,它刺激機體產生中和抗體,可中和病毒的感染[5-7]。本研究對上海地區2007-2008年分離自活禽市場的11株 H9N2亞型A IV毒株的PB2,PB1,HA,NP和NA進行了測序,從分子生物學角度了解各毒株間的差異和變異規律,進而了解上海地區該亞型禽流感病毒的分布及流行規律[8]。

1 材料與方法

1.1 病毒和雞胚 A/Chicken/Shanghai/Q0702/07(簡寫為Ck/SH/Q0702/07);A/Chicken/Shanghai/Q0704/07(簡寫為Ck/SH/Q0704/07);A/Chicken/Shang hai/Q0707/07(簡寫為Ck/SH/Q0707/07);A/Chicken/Shanghai/Q0709/07(簡寫為Ck/SH/Q0709/07);A/Chicken/Shanghai/Q0712/07(簡寫為 Ck/SH/Q0712/07);A/Chicken/Shanghai/Q0801-1/08(簡寫為 Ck/SH/Q0801-1/08);A/Chicken/Shanghai/Q0801-2/08(簡寫為Ck/SH/Q0801-2/08);A/Chicken/Shanghai/Q0808-1/08(簡寫為Ck/SH/Q0808-1/08);A/Chicken/Shanghai/Q0808-2/08(簡寫為 Ck/SH/Q0808-2/08);A/Chicken/Shanghai/Q0812-1/08(簡寫為Ck/SH/Q0812-1/08);A/Chicken/Shanghai/Q0812-2/08(簡寫為Ck/SH/Q0812-2/08);由本實驗室于2007年至2008年從上海地區的活禽批發市場分離、鑒定。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。H9熒光RTPCR試劑盒由深圳匹基提供。新城疫陽性血清,禽流感血凝素分型血清(H5、H9)由哈爾濱獸醫研究所提供。AMV反轉錄酶等試劑均購自寶生物(大連)工程公司;特異引物由寶生物(大連)工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的初步鑒定 首先對雞氣管和泄殖腔樣品用H9熒光RT-PCR試劑盒進行檢測,將 H9陽性樣品處理后接種雞胚尿囊腔,將分離毒尿囊液應用β-微量法進行 HA試驗,以檢測其血凝性及 HA效價。根據 HA試驗中所測得的 HA效價,將分離毒尿囊液配制成4單位的溶液,分別用新城疫陽性血清,禽流感 H5和 H9陽性血清進行 H I試驗,以檢測該分離物的血凝性是否能被禽流感 H9陽性血清所抑制,詳細步驟按照GB/T 18936-2003高致病性禽流感診斷技術。

1.2.2 引物的設計及合成 根據 GeneBank上已發表的序列,針對其5個基因片段 PB2,PB1,HA,NP和NA基因分別設計了相關引物。由于PB2和PB1基因片段較長,所以分成兩段進行擴增,引物由上海英駿生物技術有限公司合成 ,見表 1。

表1 引物序列和目的片段長度Table 1 Primer sequence and am plified product length

1.2.3 病毒RNA的提取和 RT-PCR擴增 用病毒 RNA提取試劑盒提取病毒基因組 RNA,具體步驟按照說明書進行。采用20μL的cDNA合成體系置于0.2m L反應管中,取溶于DEPC處理水中的A IV RNA樣品9μL,分別加入上游引物3μL,5倍 RT-PCR緩沖液4μL,dNTPs(10 mmol/L)2.5μL,RNA酶抑制劑0.5μL,AMV反轉錄酶2μL,用無RNase的超純水加至總體積為20μL,置于 PCR儀中進行cDNA合成,以30℃10 min,42℃60 min,進入 PCR擴增。PCR反應體系100μL:在 PCR反應管中分別加入cDNA 10 μL,上、下游引物各 3μL(20 pmol/μL),10 ×LA PCR Buffer10μL,dNTPs(2.5mmol/L)10μL,M gCl2(25 mmol/L)8μL,LA Taq DNA 聚合酶 0.5μL(5U/μL),滅菌超純水加至100μL,置于PCR儀中進行PCR擴增。首先95℃預變性2min,然后進行以94℃30s,55℃60s(HA,PB1前半段,PB1后半段,NP這4個基因的退火溫度為55℃,NA,PB2前半段和PB2后半段退火溫度為52℃),72℃180s的 PCR循環,進行40個循環后于72℃延伸10min。

1.2.4 基因片段的cDNA克隆、鑒定和測序 RT-PCR產物電泳經凝膠回收后,按pMD 18-T載體說明書進行連接、轉化,用 Eco RI和 H in d進行雙酶切鑒定;鑒定為陽性克隆后送英駿生物有限公司測序。

1.2.5 基因cDNA核苷酸序列及推導的氨基酸序列分析比較 借助DNA Star4.0分析軟件,通過Jotun Hein方法分析比較所得序列的同源性以及一些關鍵位點的變化情況。1.2.6 繪制系統發育樹 借助M EGA 3.1分析軟件,確定這11個毒株PB2,PB1,HA,NP和NA 5個基因片段的遺傳分類情況。

2 結 果

2.1 病毒的初步鑒定結果 這11株病毒感染的雞胚尿囊液血凝性能夠被 H9型陽性血清所抑制,而不能被 H5型陽性血清所抑制,表明這11株病毒均為 H 9亞型。

2.2 PB2,PB1,HA,NP和NA基因cDNA RTPCR擴增 以病毒RNA為模板,利用特異性引物,通過RT-PCR方法均擴增出特異性條帶,其大小與預期完全相符。

2.3 cDNA全序列同源性比較以及一些關鍵位點的分析 11株 H9N2亞型A IV的HA基因詳細分析見《2007-2008年上海地區 H9亞型禽流感病毒HA基因序列分析》(中國動物傳染病學報,2010,18(4):41-46)。這11株病毒在NA基因頸部均存在9個核苷酸的缺失(206-214位)。所有毒株的PB2蛋白627位氨基酸和701位氨基酸均為 E和D,表明這些毒株均為禽源。這11株 H9N 2亞型A IV毒株的NA,NP,PB2和PB1基因核苷酸序列同源性分別為93.7～99.8%,91.1～99.9%,85.3～99.9%和92.1～100%。

2.4 繪制系統發育樹 借助M EGA 3.1分析軟件,建立 H 9N 2亞型禽流感病毒 PB2,PB1,HA,NP和NA的系統發育樹,見圖1。

2.5 11株分離株的5個基因片段的遺傳發生關系

對2007年分離的5株,2008年分離的6株進行了 HA,NA,PB1,PB2和NP5個基因片段的進化樹分析,各片段所屬基因型如表2所示。除了 Ck/SH/Q0707/07和Ck/SH/Q0709/07這兩個毒株的PB2基因屬于Ck/Bei/1/94系,其余9個毒株的5個基因片段組成方式均相同。

表2 H9亞型禽流感病毒的基因分型Table 2 The genotypes of H9N2 subtype avian influenza virus

3 討 論

總的來說,11株毒株均為重組體。通過基因序列分析,上海地區2007-2008年分離的這11株H9N2亞型禽流感 HA基因同源性最高達到99.5%,推導的氨基酸同源性最高為99.6%;該研究的11個分離株均為低致病性禽流感病毒[9]。

這11株病毒在NA基因頸部均存在9個核苷酸的缺失(206-214位),有研究報道表明Ck/Bei/1/94病毒的NA基因可能是該分支中其它病毒NA基因的祖先,在其進化過程中發生了該部位的核苷酸缺失,這也進一步說明NA基因頸部的某些區段對于流感病毒的復制并不是必須的,可以通過對流感病毒頸部進行修飾,用于開發流感病毒載體。劉金華等[10]報道在我國分離到的12株 H 9N 2亞型禽流感病毒的NA基因頸部都存在著9個核苷酸的缺失,并被認為是我國 H9N 2亞型禽流感病毒的一個分子標簽。

2007年分離的5個毒株,其5個測序片段(HA,NA,PB1,PB2和NP)的組成方式有兩種,到2008年時,只有一種,表明隨著時間的改變,基因型是在逐漸改變的,而且主要發生在 PB2基因由Ck/Bei/1/94系轉變成Qa/H K/G1/97系。

上海地區分離的這11個毒株均屬于Ck/Bei/1/94系,與目前在上海使用的疫苗株Ck/SD/6/96同屬于一個譜系,在某種程度上表明現有的疫苗在H9N 2亞型禽流感防控中仍起著作用,但其內部基因片段已發生明顯變化,所以在今后的工作中加強H9N2亞型禽流感流行病學監測是非常必要的。

圖1 2007-2008年中國上海地區 H9N2亞型禽流感病毒NA(59-1235位核苷酸),NP(2-1445位核苷酸),PB1(182-1080位核苷酸)和PB2(32-2228位核苷酸)的基因進化樹。本研究中的11株病毒和疫苗株用粗體標記。Fig.1 Phylogenetic trees of the NA(positions59 to 1235),NP(positions2 to 1445),PB1(positions182 to1080)and PB2(positions32 to 2228)genes of the H9N2 avian influenza viruses in Shanghaiof China from 2007 to 2008.The method used is described in the legend to Fig.4.Viruses characterized in this study are highlighted in bold and the vaccine strain is in bold.＊BJ:Bei,Beijing;CA:California;Ck,chicken;Dk,duck;GD,Guangdong;Gf,guinea fow l;Gs:Goose;GX,Guangxi;GZ,Guangzhou;HK,Hong Kong;HLJ,Heilongjiang;JS:Jiangshu;NC,Nanchang;NJ,Nanjing;Pg,pigeon;Ph,pheasant;Qa,quail;SD,Shandong;SH,Shanghai;ST,Shantou;Ty,turkey;VNM,Vietnam;WDk,wild duck;W I,W isconsin;YN,Yunnan

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Phylogenetic analysis of H9N2 subtype avian influenza virus isolates in Shanghaiarea from 2007 to 2008

(Shanghai Center for A nim a l D isease Control and Prevention,Shanghai 201103,China)

GE Fei-fei,L IU Jian,JU Hou-bin,ZHANGWei-yi,ZHOU Jin-ping

In order to exp lore the genetic variation and molecular characteristics of H9N2 subtype avian influenza viruses in Shanghaiarea from 2007 to 2008,eleven H9N 2 subtype avian influenza viruses(A IV s)were isolated from live poultry markets of Shanghai including five isolates from 2007 and six isolates from 2008.These specimenswere paired tracheal and cloacal swabs.Eleven strains of influenza A viruses were determined as H9 subtype by fluorescence RT-PCR kit and then isolated by using 10-day-old specific-pathogen-free chicken eggs.They were further identified as H9 subtype by H I test.The cDNA of PB2,PB1,HA,NP and NA were amp lified by RT-PCR and sequenced.Phylogenetic analysis of the H9 HA gene showed that all of the H9 viruses are incorporated with the lineage rep resented by Ck/Bei/1/94.There are two typesof segment formulation among these isolates.H5 segment have already reassorted with these H9N2 A IV,so it is necessary to enhance epidemiological survey of H9N 2 A IV.

H9N2 subtype avian influenza;sequence analysis;phylogenetic relationship

S852

A

1002-2694(2011)08-0696-04

＊上海市科技興農重點攻關項目“上海地區 H9N2亞型禽流感病毒分子變異和免疫技術的研究”(No.2007(3-4))資助

周錦萍,Email:qyfgff2369@yahoo.com.cn

上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103

2011-02-15;

2011-04-17