尼莫地平對神經元退行性變模型小鼠腦組織中鐵離子的影響研究Δ

袁野，王曉燕，楊俊卿，周岐新#

（1.重慶醫科大學藥學院藥理學教研室，重慶市 400016；2.重慶醫藥工業研究院有限責任公司，重慶市 400061）

尼莫地平對神經元退行性變模型小鼠腦組織中鐵離子的影響研究Δ

袁野1＊，王曉燕2，楊俊卿1，周岐新1#

（1.重慶醫科大學藥學院藥理學教研室，重慶市 400016；2.重慶醫藥工業研究院有限責任公司，重慶市 400061）

目的：探討尼莫地平對神經元退行性變模型小鼠腦組織中鐵離子的影響。方法：取小鼠隨機分為假手術組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和尼莫地平高、中、低（80、40、20mg·kg－1）劑量組，每組35只，后4組腦室內注射0.25%氯化鋁2μL，每天1次，連續5d，建立神經元退行性變小鼠模型，假手術組注射等體積人工腦脊液；5d后各組灌胃給予相應藥物，每天2次，連續30d，末次灌胃24h后觀察其腦組織的病理學變化，考察海馬組織中丙二醛（MDA）、血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白、鋁離子和鐵離子水平變化。結果：與模型組比較，尼莫地平高劑量組神經元損傷明顯減輕，其中MDA、HO-1蛋白和鐵離子水平明顯降低（P＜0.05）；其余指標及尼莫地平中、低劑量組各項指標均無明顯變化。結論：尼莫地平可能通過抑制HO-1蛋白表達維持鐵離子代謝平衡，發揮緩解神經元退行性變的作用。

鋁；鐵；血紅素加氧酶；神經元退行性變；尼莫地平；小鼠

神經元退行性變疾病病因復雜，包括基因突變、腦血管疾病、氧化應激和金屬離子異常等多種因素。有研究[1]發現，鐵離子異常升高與神經元退行性變疾病的進展密切相關。體內鐵離子主要來源于食物和血紅素降解，其中以血紅素降解為主。血紅素加氧酶（HO）是血紅素降解的限速酶，分為3種亞型，其中HO-1為誘導型酶，在腦內廣泛分布，以海馬組織為甚，是血紅素降解的主要通路[2]。HO-1可催化血紅素降解除生成鐵離子外，還生成一氧化碳和膽綠素。尼莫地平屬于二氫吡啶類鈣通道拮抗藥，主要用于缺血性腦血管疾病及其并發癥的治療[3]。臨床研究[4]證明，尼莫地平可改善輕、中度認知障礙患者的記憶力和專注力，但其作用機制尚待研究。同時，研究[5]發現尼莫地平可抑制HO-1表達。但其能否通過抑制HO-1表達，調節鐵離子濃度，發揮抗神經元退行性變作用尚未見文獻報道。筆者前期實驗[6]已證實鋁過負荷致神經元退行性變伴有鐵離子濃度異常升高，因此本實驗擬采用鋁過負荷建立神經元退行性變小鼠模型，探討尼莫地平對其腦組織中鐵離子的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電感耦合等離子體原子發射光譜儀（美國PE公司）；3K30型低溫超速離心機（美國Sigma公司）；UV-265紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；凝膠成像系統、凝膠圖像分析系統、微型印跡電泳轉移系統、酶標儀（美國Bio-Rad公司）；超聲勻漿儀（德國Roche公司）。

1.2 試藥

尼莫地平片（浙江正大青春寶藥業有限公司，批號：1007002，規格：每片20mg）；兔抗鼠HO-1多克隆抗體（美國Oncogene公司，批號：sc-136960）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A003-2）。

1.3 動物

清潔級NIH小鼠，♂，體重27～29g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（渝）2007-0001。

2 方法

2.1 建模

參照文獻[7]方法，取小鼠灌胃4%水合氯醛400mg·kg－1麻醉，俯臥固定，將外徑0.6mm、內徑0.4mm的不銹鋼導管植入左側腦室（顱骨正中線左側1.3mm，前囟后方0.3mm，深度2.0mm），手術全程動物肛溫保持在（36±0.5）℃，手術7d后腦室內注射0.25%氯化鋁2μL，每天1次，連續5d，建立神經元退行性變模型。

2.2 分組與給藥

根據人用藥劑量換算，取175只小鼠隨機分為假手術組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和尼莫地平低、中、高（20、40、80mg·kg－1）劑量組，每組35只。后4組小鼠按“2.1”項下方法建模，假手術組腦室內注射相同劑量的人工腦脊液；5d后各組灌胃給予相應藥物，每天2次，連續30d。

2.3 組織病理學分析

末次灌胃24h后，以4%水合氯醛麻醉小鼠，經左心室快速滴入肝素化磷酸緩沖液50mL，再緩慢滴入4%多聚甲醛50mL，同時剪碎肝臟作為血液和灌注液出口。之后快速分離各組小鼠腦組織，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切冠狀切片，切片厚8μm，常規蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下進行組織病理學觀察。

2.4 海馬組織中MDA含量的檢測

采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，分離各組小鼠的海馬組織，制備10%組織勻漿。取10%組織勻漿液0.1mL，加入硫代巴比妥酸，充分混勻，100℃水浴40min，冰浴終止反應，于532nm波長處測定光密度（OD）值。以四乙氧基丙烷作為標準品制備標準曲線，根據標準曲線計算丙二醛（MDA）含量。

2.5 海馬組織中HO蛋白表達的檢測

采用蛋白質印跡（Western blot）法，冰面分離各組小鼠的海馬組織，按照100mg組織∶1mL裂解液（10mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（Tris-HCl），0.15mol·L－1氯化鈉，1%乙基苯基聚乙二醇，1%脫氧膽酸，0.1%十二烷基磺酸鈉，1mg·L－1亮抑酶肽，1mg·L－1乙酰抑胃肽，1mg·L－1抑肽酶，10%苯甲基磺酰氟）的比例混合，4℃冰浴勻漿，超聲破碎，15000r·min－1離心30min，取上清液按二喹啉甲酸法蛋白定量，把蛋白質樣品調成1mg·mL－1備用。取蛋白樣品（40μg總蛋白/泳道），12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（積層膠20mA，分離膠100V）后電轉移至二氟化樹脂膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，按1∶200的濃度加入HO-1和β-肌動蛋白（β-actin）一抗，37℃孵育2h，漂洗3次，每次5min。按1∶5000的濃度加入二抗，37℃孵育1h，漂洗5次，每次5min，化學發光試

所有實驗結果用±s表示，采用SPSS 12.0統計軟件進行單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。劑反應2min，凝膠成像系統攝像，采用Quantity One圖像分析軟件進行圖像分析。以HO-1灰度值與β-肌動蛋白灰度值比值表示蛋白表達水平，比值越大，則蛋白表達越高。

2.6 海馬組織中鐵離子和鋁離子水平的檢測

采用電感耦合等離子體原子發射光譜法，將各組小鼠海馬組織置于1.0mL濃硝酸中，室溫消化1h，放入65℃烤箱，4h后加入5mL去離子水，1800r·min－1離心5min，取上清液，分別于238.2、309.27nm波長處檢測鐵離子和鋁離子水平。

2.7 統計學處理

3 結果

3.1 組織病理學結果

與假手術組比較，尼莫地平低、中、高劑量組和模型組均可見不同程度CA1區神經元形態改變、核染色加深、核固縮，其中模型組最嚴重，尼莫地平中、低劑量組次之，尼莫地平高劑量組最輕；模型組還可見細胞層次減少、排列紊亂，海馬組織正常結構毀損。各組小鼠海馬組織病理學變化詳見圖1。

圖1 各組小鼠海馬組織病理學變化圖A.假手術組；B.尼莫地平高劑量組；C.尼莫地平中劑量組；D.尼莫地平低劑量組；E.模型組Fig1 Pathological change of hippocampus in mice of each groupA.sham operation group；B.nimodipine high-dose group；C.nimodipine medium-dose group；D.nimodipine low-dose group；E.model group

3.2 海馬組織中MDA含量的變化

與假手術組比較，模型組和尼莫地平低、中、高劑量組小鼠MDA含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，尼莫地平高劑量組小鼠MDA含量明顯降低（P＜0.05），尼莫地平中、低劑量組無顯著差異，具體結果見表1。

表1 各組小鼠海馬組織中MDA和HO-1蛋白水平比較（±s，n＝5）Tab1 Comparison of the levels of MDA and HO-1protein expression in hippocampus in mice of each group（±s，n＝5）

表1 各組小鼠海馬組織中MDA和HO-1蛋白水平比較（±s，n＝5）Tab1 Comparison of the levels of MDA and HO-1protein expression in hippocampus in mice of each group（±s，n＝5）

與假手術組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別模型組尼莫地平低劑量組尼莫地平中劑量組尼莫地平高劑量組假手術組MDA/nmol·mg－1 0.717±0.081＊0.723±0.075＊0.551±0.072＊0.397±0.039＊#0.205±0.044HO-1蛋白0.23±0.009＊＊0.25±0.015＊＊0.19±0.012＊＊0.14±0.007＊#0.11±0.010

3.3 海馬組織中HO-1蛋白表達的變化

與假手術組比較，模型組和尼莫地平低、中、高劑量組小鼠的HO-1蛋白表達明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，僅尼莫地平高劑量組小鼠的HO-1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。各組小鼠海馬組織中HO-1蛋白水平比較見表1，電泳結果見圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織中HO-1蛋白的表達1.模型組；2.尼莫地平低劑量組；3.尼莫地平中劑量組；4.尼莫地平高劑量組；5.假手術組Fig2 Protein expression of HO-1in hippocampus of mice of each group1.model group；2.nimodipine low-dose group；3.nimodipine medium-dose group；4.nimodipine high-dose group；5.sham operation group

3.4 海馬組織中鋁離子和鐵離子的含量變化

與假手術組比較，模型組和尼莫地平低、中、高劑量組小鼠的鋁離子、鐵離子含量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，僅尼莫地平高劑量組小鼠的鐵離子含量明顯降低（P＜0.05）。各組小鼠海馬組織中鋁離子和鐵離子水平比較詳見表2。

表2 各組小鼠海馬組織中鋁離子和鐵離子水平比較（±s，n＝5）Tab2 Comparison of aluminium ion and ferri ion in hippocampus of mice of each group（±s，n＝5）

表2 各組小鼠海馬組織中鋁離子和鐵離子水平比較（±s，n＝5）Tab2 Comparison of aluminium ion and ferri ion in hippocampus of mice of each group（±s，n＝5）

與假手術組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別模型組尼莫地平低劑量組尼莫地平中劑量組尼莫地平高劑量組假手術組鐵離子/μg·g－1（組織）54.01±2.31＊＊57.73±3.07＊＊49.42±3.68＊＊36.09±2.85＊#22.54±4.48鋁離子/μg·g－1（組織）2.08±0.10＊＊2.03±0.11＊＊2.11±0.08＊＊2.05±0.13＊＊0.35±0.04

4 討論

有研究[8]證實，鋁離子具有神經毒性，鋁過負荷可損傷神經突觸，導致認知功能障礙。在生理條件下，HO-1具有抗氧化應激作用。在鋁過負荷條件下，HO-1過表達是否仍能發揮抗氧化應激尚未見相關報道。但有研究[9]證實，鋁離子可阻斷鐵蛋白的合成，上調游離鐵離子水平。因此，在鋁過負荷的情況下，盡管HO-1過表達可促進抗氧化劑膽綠素的生成，但鐵離子也隨之增加，且無法通過合成鐵蛋白“解毒”，使得鐵離子水平持續升高。與膽綠素被一次性消耗不同，鐵離子可反復通過芬頓反應促進自由基生成，導致氧化應激平衡失調。本實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠海馬組織神經元出現嚴重損傷，正常結構毀損，其中MDA、鐵離子含量、HO-1蛋白表達均明顯升高。由此表明，在鋁過負荷條件下，HO-1過表達可能通過促進鐵離子生成，加劇氧化應激失衡的發展，誘發神經元凋亡。

與模型組比較，尼莫地平高劑量組小鼠的鐵離子含量、MDA、HO-1蛋白表達均顯著降低，神經元損傷顯著緩解，而中、低劑量組無顯著變化。表明尼莫地平可能通過抑制HO-1表達，減少鐵離子生成發揮抗氧化應激作用，且具有劑量依賴性。由于尼莫地平不能逆轉鋁離子抑制鐵蛋白合成所致的鐵離子濃度升高，因此尼莫地平并不能使鐵離子完全恢復至正常水平，這可能也是尼莫地平不能完全緩解神經元損傷的原因之一。

綜上所述，尼莫地平可能通過抑制HO-1蛋白表達維持鐵離子代謝平衡，發揮緩解神經元退行性變作用。

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Effect of Nimodipine on Ferri Ion in Cerebral Tissue of Rats with Neurodegenerative Disease

YUAN Ye，YANG Jun-qing，ZHOU Qi-xin
（Dept.of Pharmacology，School of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）
WANG Xiao-yan
（Chongqing Pharmaceutical Research Institute Co.，Ltd.，Chongqing 400061，China）

OBJECTIVE：To investigate the effect of nimodipine on ferri ion in cerebral tissue of rats with neurodegenerative disease.METHODS：Mice were randomly divided into sham operation group（normal saline），model group（normal saline），nimodipine high-dose，medium-dose and low-dose groups（80，40，20mg·kg－1），with each group of 35mice.The latter 4groups

0.25%aluminum chloride 2μL intracerebroventricularly once a day for five days to induce neurodegenerative model.Artificial cerebrospinal fluid 2μL was injected in the same way in sham operation group.Five days later，all groups were given relevant medicine intragastrically twice a day for 30d.Histological observations was performed 24h after last intragastical injection to evaluate the levels of MDA，Heme oxygenase-1（HO-1），aluminium ion，ferri ion.RESULTS：Compared with model group，neural damage，MDA，HO-1protein and ferri ion level of nimodipine high-dose group were decreased significantly（P＜0.05）.Other index and all index of nimodipine medium-dose and low-dose groups had no different change.CONCLUSIONS：Nimodipine could suppress the neurodegenerative development through inhibiting the expression of HO-1and keeping the balance of ferri ion metabolism.

Aluminum；Ferri；Heme oxygenase；Neurodegenerative disease；Nimodipine；Mice

R338；R743.31；R965

A

1001-0408（2011）17-1553-03

Δ國家自然科學基金資助項目（30672211）

＊主管藥師。研究方向：神經藥理學。電話：023-63715677。E-mail：yuanyecq@yahoo.com.cn

#通訊作者：教授，博士研究生導師。研究方向：神經藥理學。E-mail：cqzhouqx@yahoo.com.cn

2011-01-11

2011-03-10）