熱療用阿霉素溫敏納米粒的制備及工藝優化Δ

樊秋平，梁嘉碧，楊海云，郭新銘，羅葆明，吳傳斌

（1.中山大學藥學院，廣州市 510006；2.中山大學附屬第五醫院，珠海市 519000；3.中山大學附屬第二醫院，廣州市 510120）

熱療用阿霉素溫敏納米粒的制備及工藝優化Δ

樊秋平1＊，梁嘉碧2，楊海云3，郭新銘2，羅葆明3，吳傳斌1#

（1.中山大學藥學院，廣州市 510006；2.中山大學附屬第五醫院，珠海市 519000；3.中山大學附屬第二醫院，廣州市 510120）

目的：制備熱療用阿霉素溫敏納米粒，并對其制備工藝進行優化。方法：合成兩親性溫敏嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL，在水溶液中自組裝形成溫敏納米粒。用滴注法制備載藥溫敏納米粒，以包封率為評價指標，通過正交設計對溫敏納米粒制備工藝中溫敏嵌段共聚物的濃度（A）、水相中阿霉素的濃度（B）、攪拌時間（C）等因素進行優化，對優化后工藝進行驗證并在4℃下貯存90d考察其穩定性。結果：合成了兩親性溫敏嵌段共聚物，其最低臨界溶解溫度（LCST）為40.3℃；最佳工藝為A0.15mg·mL－1、B 0.045mg·mL－1、C 1h，3批制劑的平均包封率為41.9%，平均粒徑（155±2.7）nm；90d內制劑外觀、粒徑和包封率無明顯變化。結論：成功制備了阿霉素溫敏納米粒，且其制備工藝可行，質量穩定。

阿霉素；溫敏納米粒；制備；正交設計；包封率；穩定性

熱療是將腫瘤區或全身加熱至有效治療溫度范圍并維持一定時間以殺滅腫瘤細胞的一種方法，作為腫瘤綜合治療的一個重要手段，在臨床上被廣泛用于實體腫瘤的治療。熱療分為局部熱療和全身熱療[1]，射頻消融（RFA）屬于局部熱療的一種方式，目前是肝癌非手術治療的主要手段，但是RFA無論應用于“大肝癌”還是“小肝癌”都存在局部復發和轉移的問題[2]。如果能通過化療方法聯合RFA進一步殺死殘存的癌細胞，便可降低局部復發和轉移問題。阿霉素（ADM）是臨床常用的抗腫瘤藥物，但其心臟、腎臟毒性大，治療指數低，從臨床應用的角度來看，應尋找一種更有效的制劑，以最大限度提高腫瘤組織內的藥物濃度，最大限度地降低心臟和腎臟藥物濃度（低毒性）[3]。聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）類溫敏藥物載體由于其設計的多樣性、最低臨界溶解溫度（LCST）的可調性，且具有被動靶向能力和定位釋放等優點被廣泛用于藥物控釋系統中[4]。鑒于上述臨床需求和綜合考慮，本研究制備了可以作為阿霉素載體的溫敏納米粒，為下一步開展阿霉素溫敏納米粒聯合RFA治療原發性肝癌研究奠定了基礎。

1 儀器與試藥

SP131320-33Q磁力攪拌熱盤（美國Thermo公司）；BS224S電子天平（德國賽多利斯公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科儀公司）；400Mde核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；UV-1800紫外分光光度計（日本島津公司）；HP1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；LGJ-10C冷凍干燥機（長沙湘儀集團）；5810R超低溫高速離心機（德國Eppendorff公司）；BS5510DTH超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS90馬爾文納米粒度分析儀（英國馬爾文公司）。

鹽酸多柔比星（深圳萬樂藥業有限公司，批號：1004E1，純度：＞98%）；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM，日本TCI公司，批號：44A8A，純度：＞98.0%）；N，N-二甲基丙烯酰胺（DMAAM，美國Alfa Aesar公司，批號：J25S041，純度：＞99.5%）；偶氮二異丁腈（AIBN）、β-巰基乙醇（2-ME）、辛酸亞錫、ε-己內酯、甲苯、無水乙醚等均為分析純；阿霉素溫敏納米粒（中山大學附屬第五醫院研制）。

2 方法與結果

本試驗先通過2個步驟合成了兩親性溫敏嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL，并對其結構和溫敏特性進行表征。兩親性溫敏嵌段共聚物在水中可自主裝成納米粒，再通過滴注法制備了載藥納米粒，用正交設計對溫敏納米粒的處方進行優化，并對納米粒的粒徑分布等進行表征。

2.1 兩親性溫敏嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL的合成和表征

2.1.1 溫敏聚合物P（NIPAM-co-DMAAM）-OH的合成。參照文獻[5]中的采用自由基聚合反應的方法。用AIBN為引發劑、2-ME為鏈增長劑進行反應。具體步驟如下：將一定量的NIPAM、DMAAM溶解在30mL的四氫呋喃中，加入適量的AIBN和2-ME，70℃條件下反應12h。整個反應過程在氬氣保護下進行。用無水乙醚沉淀產物，沉淀物用少量的四氫呋喃（THF）復溶，再用無水乙醚沉淀，如此反復2次，所得產物在真空干燥箱（40℃）中干燥48h。

2.1.2 兩親性溫敏嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL的合成。參照文獻[5]的方法，利用端基羥基轟擊己內酯開環反應合成此嵌段共聚物。具體操作如下：取溫敏聚合物P（NIPAM-co-DMAAM）-OH和一定量的ε-己內酯，在催化劑辛酸亞錫條件下，140℃反應24h，整個反應過程在氬氣保護下進行。反應產物用過量乙醚沉淀，沉淀物用THF復溶后，再用乙醚沉淀，重復2次，所得產物在真空干燥箱（40℃）中干燥48h。

2.1.3 溫敏嵌段共聚物的結構表征。用核磁共振波譜儀對上述 合 成 的 聚 合 物 P（NIPAM-co-DMAAM）-OH、P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL進行結構特征的鑒定，其核磁共振（1H-NMR）圖譜詳見圖1。

圖1 1H-NMR圖譜Fig1 1H-NMR spectra

圖1A中由于用重水作溶劑，-OH上的活潑氫被交換，其質子峰消失，而在δ＝4.7ppm處出現與HOD相應的單峰，表明端基羥基被連接上。圖1B中，δ＝4.7ppm的峰消失，而在1～4ppm之間，出現眾多的多重峰，進行峰歸屬為聚合物中飽和烴基—CH3、—CH2—、—CHCO的峰，表明ε-己內酯開環而引入了大量的飽和烴基。結構表征表明成功合成了溫敏兩親嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL。

2.1.4 溫敏嵌段共聚物的LCST的測定。PNIPAM類溫敏共聚物水溶液隨著溫度的變化會出現相轉變，此轉變溫度成為最低臨界溶解溫度，即LCST。當溫度低于LCST時，聚合物分子呈現溶解特性；當環境溫度升至其LCST以上時，聚合物呈現出疏水特性發生皺縮，導致聚合物溶液由透明變成渾濁。文獻[6]中常用濁度法、以LCST為指標來測量兩親溫敏嵌段共聚物的溫敏特性，具體方法如下：制備適量濃度為0.1mg·mL－1的P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL水溶液，將其置于恒溫（30～50℃）水浴中，溫度每升高1℃平衡10min，用紫外可見分光光度計在500nm波長處測其透光率（T），透光率為50%時的溫度為其LCST。測定結果詳見圖2。

圖2 溫敏嵌段共聚物的溫度-透光率曲線Fig2 Curve of temperature-transmittancy of thermosensitive block copolymer

從圖2上可以看出，當環境溫度從30℃升至39℃期間，聚合物溶液的透光率幾乎無變化；當溫度在40～41℃時，聚合物溶液的透光率急劇下降。因此，得到聚合物的LCST在40～41℃之間，約為40.3℃。

2.2 阿霉素溫敏納米粒的制備

用滴注法制備阿霉素溫敏納米粒。方法如下：取一定量溫敏嵌段共聚物分散至5mL THF中，超聲直至完全溶解后，滴加至100mL含藥（阿霉素）溶液中。邊滴加邊攪拌，攪拌一定時間后即得阿霉素溫敏納米粒的混懸液。將混懸液轉移至透析袋中（Mw：3500），用蒸餾水透析2d（換液6次，每次1000mL），除去未包封的藥物和THF，透析完后冷凍干燥，即得載藥微粒粉末，密封后于4℃冰箱中存放。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件。色譜柱：Agilent Zorbax ODS-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：5mol·L－1H3PO4水溶液-乙腈-甲醇-異丙醇（65%∶15%∶10%∶10%）；選用熒光檢測器，檢測波長：激發波長505nm，發射波長550nm；柱溫：室溫；進樣量：20μL。2.3.2標準曲線的制備。標準液的制備方法：按照“2.2”項下的制備方法，制備空白納米粒混懸液，離心（12000r·min－1）30min后取上清液，用離心后的溶液作溶劑，精密制備一系列濃度的阿霉素標準溶液，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg·mL－1，進樣測定其峰面積（Y），以相應的Y對其溶液濃度（X，μg·mL－1）進行線性回歸，求得標準曲線方程：Y＝0.0011X+0.0227（R2＝0.9996），結果表明阿霉素檢測濃度線性范圍為0.05～10μg·mL－1。

2.3.3 回收率試驗。按照“2.3.2”項下標準曲線的制備方法制備高、中、低（10、1、0.05μg·mL－1）3個濃度的阿霉素樣品，每個濃度5個樣品。與隨行標準曲線同法測定，每個樣品分析測定1次，測定結果用隨行標準曲線的回歸方程計算樣品的濃度，并以測定值平均值與制備的理論濃度值比較，即為回收率，結果平均回收率為98.4%（RSD＝1.92%）。

2.3.4 精密度試驗。分別制備高、中、低（10、1、0.05μg·mL－1）3個濃度的阿霉素標準液，于同日內測量，每種濃度連續進樣5次，計算批內精密度；連續測量5d，每日進樣測量1次，計算批間精密度。結果批內RSD小于1.02%，批間RSD小于1.97%。

2.4 包封率測定

采用高速離心法測定阿霉素納米粒的包封率：取一定量的阿霉素溫敏納米粒混懸液，離心（12000r·min－1）30min，取上清液，上清液中的藥物即為未包封藥物。按照“2.3.1”項下條件進樣測定，按照以下公式計算包封率：

2.5 阿霉素溫敏納米粒制備工藝的優化

根據預試驗結果，對影響包封率的3種主要因素：溫敏嵌段共聚物（以下簡稱共聚物）的濃度（A，mg·mL－1）、水相中阿霉素的濃度（B，mg·mL－1）、攪拌時間（C，h）進行正交設計，每個因素3個水平，采用正交表L9（34），以包封率為評價指標來進行工藝優化。因素水平見表1，工藝優化的正交設計結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表Tab1 Factors and levels

表2 正交試驗結果Tab2 Result of orthogonal experiments

表3 方差分析Tab3 Analysis of variance

對包封率進行方差分析可以看出，3種因素A、B、C均有顯著性差異，再結合直觀分析，確定最佳制備工藝為A2B3C1，即共聚物濃度為0.15mg·mL－1，水相中阿霉素濃度為0.045mg·mL－1，攪拌時間為1h。

2.6 工藝驗證

按“2.2”項下方法及選定的工藝條件制備溫敏納米粒3批，測定其包封率，結果分別為40.8%、43.2%、41.6%，平均包封率為41.9%。

2.7 阿霉素溫敏納米粒的粒徑和穩定性

2.7.1 載藥納米粒粒徑測定。取阿霉素溫敏納米粒混懸液適量，用納米粒度分析儀測定其粒徑，結果粒徑分布較窄，粒徑均勻，平均粒徑為（155±2.7）nm，詳見圖3。

圖3 阿霉素溫敏納米粒的粒徑分布圖Fig3 Particle size distribution ofAdriamycin nanoparticles

2.7.2 阿霉素溫敏納米粒穩定性觀察。將制備的樣品于4℃冰箱中保存3個月（90d），取出考察其外觀、粒徑和包封率的變化。結果，4℃儲存條件下，阿霉素溫敏納米粒外觀仍呈現均一、透明的分散體系，粒徑和包封率也變化不大，由此看出阿霉素溫敏納米粒具有良好穩定性，詳見表4。

表4 樣品穩定性結果Tab4 Stability of samples

3 討論

PNIPAM是一類被廣泛研究的溫敏材料，其聚合物相變溫度約32℃，當與其他親水或疏水單體共聚合時可得到具有不同LCST的高分子：NIPAM與親水性單體（DMAAM、HEMA等）共聚可以提高LCST[7]。在本研究中，為了得到LCST高于人體生理溫度（37℃）的溫敏共聚物，讓NIPAM與一定比例的DMAAM共聚，最終通過調節比例使共聚物的LCST提高到40.3℃。通過加入不同比例的DMAAM，可以得到不同LCST的溫敏共聚物，與參考文獻[7]中的結論相符。

納米粒的制備方法主要有透析法、溶劑蒸發法和滴注法等。本文采用的是滴注法，該方法簡單易行，且所制備的納米粒粒徑均勻，粒徑分布為（155±2.7）nm，平均包封率為41.9%，室溫放置比較穩定。

國內、外對納米粒中藥物包封率的測定大多采用葡聚糖凝膠過濾法和超速離心法[8，9]，前者較費時且效果不好，因此，本研究采用超速離心法測定納米粒的包封率。考慮到高速離心過程中可能導致納米粒中藥物泄露和空白囊材的干擾等，在制備標準曲線時，用離心過的空白囊材溶液作溶劑來制備標準溶液，并對此法的回收率進行考察，多次測量后平均回收率為98.4%，RSD為1.92%。方法學結果表明此方法比較穩定，可以用來測定阿霉素溫敏納米粒的包封率。

惡性腫瘤的綜合治療已成為大勢所趨，如聯合化療和熱療，二者聯合具有協同效應。本研究合成的溫敏納米粒的LCST為40.3℃，而在人正常體溫下（37℃），由于環境溫度低于其LCST，藥物被包裹在載體中，當局部通過熱療加熱使溫度高于其LCST（40.3℃）時，可使局部（加熱部位）藥物釋放增加，而不引起藥物在其他部位的釋放。熱療聯合藥物化療理論上可以增加惡性腫瘤治愈率，降低全身的毒副作用，但是有關其聯合RFA時藥物控釋特性和相關動物體內實驗還有待進一步研究。

綜上所述，成功制備了阿霉素溫敏納米粒，且其制備工藝可行，質量穩定。

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Preparation of Adriamycin Thermosensitive Nanoparticles for Hyperthermia Therapy and Optimization of Preparation Technology

FAN Qiu-ping，WU Chuan-bin
（School of Pharmacy，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China）
LIANG Jia-bi，GUO Xin-ming
（The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China）
YANG Hai-yun，LUO Bao-ming
（The Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China）

OBJECTIVE：To prepare Adriamycin thermosensitive nanoparticles for hyperthermia therapy，and to optimize the preparation technology of it.METHODS：Amphiphilic block copolymer poly（N-isopropyl-acrylamide-co-N，N-dimethylacrylamide）-b-poly（ε-caprolactone）was synthesized.Owing to their amphiphilic characteristics，the block copolymer formed self-assembled thermosensitive nanoparticles in aqueous milieus.Nanoparticles were prepared using solvent injection method.The preparation technology of nanoparticles was optimized by orthogonal experiments using encapsulation efficiency as index with the concentration of thermosensitive polymer（A），the concentration of adriamycin in water phase（B）and stirring time（C）as factors.Optimized formula was validated and the stability of nanoparticles stored at 4℃ for 90days was investigated.RESULTS：The amphiphilic block copolymer was synthesized.And its lower critical solution temperature（LCST）was around 40.3℃.Optimal formula was as follows：A of 0.15mg·mL－1，B of 0.045mg·mL－1，C of 1h.The average encapsulation efficiency were 41.9%and the mean diameters of nanoparticles were（155±2.7）nm.The appearance，particle size and encapsulation efficiency of nanoparticles had no significant change within 90days.CONCLUSION：Adriamycin thermosensitive nanoparticles have been prepared successfully，and preparation technology is feasible and stable in quality.

Adriamycin；Thermosensitive nanoparticles；Preparation；Orthogonal experiment；Encapsulation efficiency；Stability

R943；R979.1

A

1001-0408（2011）17-1580-04

Δ國家自然科學基金資助項目（30872996）；廣東省科技計劃項目（2009B030801081）

＊碩士研究生。研究方向：藥物新劑型和新技術。E-mail：fqpby2004@163.com

#通訊作者：教授，博士研究生導師。研究方向：緩、控釋靶向制劑。E-mail：cbwu2000@yahoo.com

2011-01-04

2011-02-17）