優化《中國藥典》羅紅霉素HPLC含量測定方法研究Δ

楊德智，徐維盛，張麗，楊世穎，呂揚

（中國醫學科學院&北京協和醫學院藥物研究所，北京市 100050）

優化《中國藥典》羅紅霉素HPLC含量測定方法研究Δ

楊德智＊，徐維盛，張麗，楊世穎，呂揚#

（中國醫學科學院&北京協和醫學院藥物研究所，北京市 100050）

目的：優化高效液相色譜法檢測羅紅霉素含量的最佳流動相條件，改善現行方法中主峰拖尾現象。方法：選取流動相中緩沖液濃度、pH值、三乙胺含量、乙腈用量為影響因素，以羅紅霉素色譜峰拖尾因子（T1）、保留時間（tR）、半峰寬（W1/2）及理論板數（N）為考察指標，設計正交試驗優化含量測定方法并與2010年版《中國藥典》含量測定方法比較。結果：優化后含量測定方法：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相：0.067mol·L－1磷酸二氫銨溶液（三乙胺含量0.3%，調pH值至7.5）-乙腈（60∶40），檢測波長：205nm，柱溫：30℃，流速：1.0mL·min－1，進樣量：20μL。優化后方法與藥典方法的比較結果：T1為1.2、1.9；tR為14.133、12.383min；W1/2為0.400、0.533；N為6916、2987。結論：優化后方法較2010年版《中國藥典》方法提高了柱效，延長了保留時間，較好地改善了色譜峰拖尾嚴重的狀況。

正交試驗；高效液相色譜法；羅紅霉素；優化；流動相；含量測定；《中國藥典》

《歐洲藥典》[1]、《英國藥典》[2]和《日本藥局方》[3]均收載了羅紅霉素的高效液相色譜（HPLC）檢測方法作為其含量測定方法，但由于試驗條件過于苛刻，且使用了高鹽濃度的緩沖液，不利于儀器設備的使用與維護。《中國藥典》2010年版二部[4]收載的羅紅霉素的HPLC檢測方法，條件與國外藥典相比，降低了鹽濃度，使用了三乙胺為掃尾劑，但在應用中發現羅紅霉素色譜峰拖尾現象仍非常嚴重。基于此，本文設計了正交試驗，使用國產儀器，以期優化液相色譜檢測條件，改善羅紅霉素的各種色譜參數，提高分離度和柱效，避免雜質影響，以實現對該藥物含量測定準確檢測的目的。

1 儀器與試藥

L6型液相色譜儀、WinLC色譜工作站（北京普析通用儀器有限責任公司）；FiveEasy pH計（瑞士Mettler Toledo公司）。

羅紅霉素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：130557-200502，含量：94.1%）；羅紅霉素化學中間體（浙江廣科藥業有限公司，批號：Z20070402，純度：94.9%）；羅紅霉素化工原料（山東濰坊三江醫藥化工有限公司，批號：20080911，純度：94.0%）；羅紅霉素原料藥（批號：H20058691，純度：94.6%，山東中亞制藥有限公司）；娃哈哈飲用純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；乙腈為色譜純，三乙胺、磷酸二氫銨、磷酸、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

對照品溶液：取羅紅霉素標準品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含1mg的溶液，即得。

供試品溶液：取樣適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含1mg的溶液，即得。

2.2 正交試驗設計

《中國藥典》[4]羅紅霉素含量測定色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.067moL·L－1磷酸二氫銨溶液（用三乙胺調節pH值至6.5）-乙腈（65∶35）為流動相，檢測波長為210nm。

綜合各國藥典所采用的羅紅霉素含量測定方法，應用正交試驗法對羅紅霉素含量測定方法進行優化，以流動相中磷酸二氫銨緩沖液濃度（A）、pH值（B）、三乙胺含量（C）、乙腈含量（D）4個因素，每個因素取3水平，分別以拖尾因子（T1）、理論板數（N）、保留時間（tR）、半峰寬（W1/2）等為考察指標，采用正交表L9（34）進行試驗，優化色譜條件，應用極差分析法對結果進行分析。因素水平各參量值見表1。

表1 因素水平表Tab1 Factors and levels

2.3 試驗條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：205nm；進樣濃度：1mg·mL－1；進樣量：20μL；柱溫：30℃。流動相試驗條件設置方案見表2。

表2 流動相設置方案表Tab2 Mobile phase program

2.4 試驗結果

以上述試驗條件分析樣品，分別記錄各試驗的tR、峰面積、T1、W1/2、N及R，數據結果見表3。

表3 試驗結果Tab3 Test results

2.4.1 以T1為指標進行結果分析見表4。

表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別代表某一因素條件下同一水平的指標之和；Ri為極差值，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中最大數減去最小數；T為指標總和。由表4數據可知，各因素對指標T1影響大小順序為C、A、D、B。即，三乙胺含量對色譜峰的T1影響最大，緩沖液濃度和乙腈用量次之，而pH值的影響最小。由表4可知，以T1為指標時，試驗3條件（A3B3C3D3）為最佳水平。

2.4.2 以tR為指標進行結果分析見表5。

由表5可知，各因素對tR影響大小順序為B、D、A、C。即pH值對色譜峰的tR影響最大，乙腈用量次之，緩沖液濃度再次，而三乙胺含量的影響最小。以tR為指標時，試驗9條件（A9B9C9D9）為最佳水平。

表4 以T1為指標的分析結果Tab4 Results of analysis using tailing factor as evaluation index

表5 以tR為指標的分析結果Tab5 Results of analysis using retention time as evaluation index

2.4.3 以W1/2為指標進行結果分析見表6。

表6 以W1/2為指標進行結果分析Tab6 Results of analysis using half-peak width as evaluation index

由表6可知，各因素對W1/2影響大小順序為D、B、A、C。即乙腈用量對色譜峰的W1/2影響最大，pH值次之，緩沖液濃度再次，而三乙胺含量的影響最小。以W1/2為指標時，試驗7條件（A7B7C7D7）為最佳水平。

2.4.4 以N為指標進行結果分析見表7。

表7 以N為指標進行結果分析Tab7 Results of analysis using theoretical plate number as evaluation index

由表7可知，各因素對N影響大小順序為B、C、A、D。即pH值對色譜峰的N影響最大，三乙胺含量次之，緩沖液濃度再次，而乙腈用量影響最小。以N為指標時，試驗3條件（A3B3C3D3）為最佳水平。

2.5 色譜條件的確定

據上述結果，綜合4個指標的最佳試驗水平，考慮到本試驗旨在改善拖尾、提高柱效，故最終選取試驗3的條件作為羅紅霉素HPLC含量測定的最優水平，即：緩沖液濃度0.067mol·L－1、流動相pH值7.5、三乙胺含量0.3%、流動相中乙腈含量40%。最終確定色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.067mol·L－1磷酸二氫銨溶液（三乙胺含量0.3%，調pH值至7.5）-乙腈（60∶40）為流動相，檢測波長：205nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min－1，進樣量：20μL。

本法與2010年版《中國藥典》比較，改變了流動相的pH值，固定了三乙胺的加入量，并提高了乙腈在流動相中的比例。選用一國產C18色譜柱，使用本檢測方法，與2010年版《中國藥典》方法比較，結果見表8。

表8 2種方法各指標結果比較Tab8 Comparison of evaluation index of 2kinds of methods

由表8可見，本法優化的試驗條件較2010年版《中國藥典》方法提高了柱效（N為《中國藥典》方法的2倍以上），在一定程度改善了色譜峰T1（由1.9降低到1.2），延長了tR（主峰tR延長了2min以上），色譜峰形更加尖銳且W1/2變窄。2種方法的色譜比較見圖1。

2.6 方法學驗證及應用

采用本文優化的羅紅霉素含量檢測條件，方法的最低檢測限為1.2μg·mL－1，定量限為4.1μg·mL－1；以色譜峰面積（y）與供試品溶液濃度（x）作圖，羅紅霉素檢測濃度在0.01～5.0mg·mL－1范圍內呈良好的線性關系，線性方程為y＝4845.3697x－35.4863（r2＝0.9999，n＝12）；精密度RSD為0.10%；低、中、高3個濃度的加樣回收率平均值為100.85%（RSD＝0.67%）；經酸、堿、高溫、光照、氧化破壞后，所有雜質與主峰的分離度良好。

圖1 2種方法色譜圖比較1.本法；2.《中國藥典》方法Fig1 Comparison of chromatograms of 2kinds of methods1.the method；2.method stated in Chinese Pharmacopoeia

采用本文優化方法，以標準品對3批羅紅霉素樣品進行了含量測定，并與現行《中國藥典》方法含量測定結果進行了比較，結果見表9。

表9 3批羅紅霉素樣品含量測定結果Tab9 Content determination of 3batches of roxithromycin samples

3 討論

本文采用正交試驗設計方法，對《中國藥典》收載的羅紅霉素含量測定的色譜條件中的流動相組成及配比進行優化設計，通過對緩沖液濃度、pH值、三乙胺含量、流動相中乙腈用量進行正交試驗，考察了各因素對羅紅霉素色譜行為的影響，為完善其檢測方法和條件提供了科學的基礎實驗數據。

本法選取的檢測波長不同于現行藥典的210nm，而改為205nm，主要是考慮羅紅霉素在紫外光區具有末端吸收，由于流動相中主要組成為水和乙腈，二者截止波長分別為200、190nm，經試驗分析其對測定結果無干擾?！睹绹幍洹?、《歐洲藥典》和《日本藥典》均選取205nm作為檢測波長，故本法最終也選取205nm作為檢測波長，提高了響應值。

方法學研究結果證明，本論文建立的HPLC檢測方法簡便、準確，具有較好的科學性與實用性，是對藥典方法的完善和提高。

利用本文建立的HPLC檢測分析方法對羅紅霉素原料藥進行了含量測定，試驗結果表明，優化后方法能夠滿足其質量控制的要求，有效地改善了羅紅霉素色譜峰拖尾嚴重的情況，拖尾因子較小，較2010年版《中國藥典》收載方法具有柱效高、對稱性好等優點，保證了含量測定結果具有更高的準確性。

[1] European Directorate for the Quality of Medicine.The European Pharmacopoeia6.0[S].Strasbourg，France：the Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe，2005：1146.

[2] The British Pharmacopoeia Commission.The British Pharmacopoeia[S].London：the Stationary Office，2007：303.

[3] Society of Japanese Pharmacopoeia.The Japanese Pharmacopoeia Fifteenth Edition[S].Tokyo：Society of Japanese Pharmacopoeia，2001：738.

[4] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：462.

Optimization of HPLC Method of Roxithromycin inChinese Pharmacopoeia

YANG De-zhi，XU Wei-sheng，ZHANG Li，YANG Shi-ying，LV Yang
（Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

OBJECTIVE：To optimize mobile phase condition of content determination of roxithromycin by HPLC，and to improve peak tailing.METHODS：Using buffer concentration，pH value of mobile phase，amount of triethylamine and acetonitrile as factors and with tailing factor（T1），retention time（tR），half-peak width（W1/2）and theoretical plate number（N）as index，the determination method was optimized by orthogonal and compared with content determination method stated inChinese Pharmacopeia（2010edition）.RESULTS：Optimal condition was as follows：C18column was used，mobile phases consisted of 0.067mol·L－1ammonium dihydrogen phosphate（0.3%TEA，pH＝7.5）-acetonitrile（60∶40）at flow rate of 1.0mL·min－1and the detection wavelength was set at 205nm.The injection volume was 20μL and the column temperature was 30℃.Optimized method was compared with that stated inChinese Pharmacopoeia.T1were 1.2and 1.9；tRwere 14.133min and 12.383min；W1/2were 0.400and 0.533；Nwere 6916and 2987.CONCLUSION：Compared with the current method inChinese Pharmacopoeia（2010edition），the optimal method is better in term of column efficiency，prolonging retention time and improving peak tailing.

Orthogonal design；HPLC；Roxithromycin；Optimization；Mobile phase；Content determination；Chinese pharmacy

R927.2；R978.1+5

A

1001-0408（2011）17-1604-03

Δ“重大新藥創制”科技重大專項“十一五”計劃項目（2009ZX09501-02）；衛生行業科研專項（200902008-02）；國家藥品標準提高研究課題（1680）

＊實習研究員。研究方向：藥物分析。電話：010-63161258。E-mail：ydz@imm.ac.cn

#通訊作者：研究員，博士研究生導師。研究方向：藥物分析。電話：010-63165212。E-mail：luy@imm.ac.cn

2010-07-16

2010-09-10）