鹽酸甲氯芬酯膠囊在健康人體內的生物等效性研究

華卡，李健和，朱運貴，易利丹，曹俊華，劉曉磊，陽巧鳳，曾小慧，羅霞

（1.湖南省腦科醫院藥劑科，長沙市 410007；2.中南大學湘雅二醫院藥學部，長沙市 410011；3.湖南省馬王堆醫院，長沙市 410016）

鹽酸甲氯芬酯膠囊在健康人體內的生物等效性研究

華卡1＊，李健和2#，朱運貴2，易利丹2，曹俊華3，劉曉磊2，陽巧鳳2，曾小慧2，羅霞2

（1.湖南省腦科醫院藥劑科，長沙市 410007；2.中南大學湘雅二醫院藥學部，長沙市 410011；3.湖南省馬王堆醫院，長沙市 410016）

目的：研究2種鹽酸甲氯芬酯膠囊在中國健康志愿者體內的生物等效性。方法：18名健康男性志愿者隨機分為2組，分別單劑量交叉口服鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑或參比制劑200mg。于服藥前0h和服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、14、24h時抽取靜脈血，采用高效液相色譜法測定血漿中對氯苯氧乙酸的濃度。通過DAS Ver 2.0軟件計算主要藥動學參數，評價2制劑的生物等效性。結果：鹽酸甲氯芬酯受試制劑與參比制劑的藥動學參數分別為：tmax（2.11±0.37）、（2.06±0.34）h，cmax（12.56±2.85）、（12.78±2.84）μg·mL－1，t1/2（5.81±2.68）、（6.00±2.14）h，AUC0～24（34.11±7.89）、（34.12±7.99）μg·h·mL－1，AUC0～∞（34.83±7.68）、（34.79±7.97）μg·h·mL－1。以AUC0～24計算，受試制劑對參比制劑的相對生物利用度為（100.7±11.7）%。 結論：2種鹽酸甲氯芬酯膠囊在中國健康志愿者體內具有生物等效性。

鹽酸甲氯芬酯膠囊；對氯苯氧乙酸；高相液相色譜法；生物等效性

鹽酸甲氯芬酯是中樞興奮藥，其化學名為對氯苯氧乙酸二甲氨基乙酸鹽，臨床主要用于治療外傷性昏迷、酒精中毒、新生兒缺氧癥、兒童遺尿癥等[1～4]。2005年版《中國藥典》二部[5]和有關文獻[6～9]采用高效液相色譜（HPLC）法測定其制劑的含量，但僅見少量文獻報道人血漿中甲氯酚酯測定方法[10]。因甲氯芬酯在體內的代謝產物為對氯苯氧乙酸，且在體內較穩定，故本試驗建立一種簡單、靈敏和快速的HPLC法測定18名中國健康志愿者口服鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑與參比制劑后血漿中對氯苯氧乙酸的濃度，計算藥動學參數和相對生物利用度，評價2制劑的生物等效性。

1 材料

1.1 儀器

1100 系列高效液相色譜儀，包括化學高級色譜數據工作站（美國Agilent公司）AL-204電子分析天平（瑞典Mettler Toledo公司）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；HY-4多用調速振蕩器（江蘇金壇市醫用儀器廠）；GL-88B旋渦混合器（江蘇海門麒麟醫用儀器廠）。

1.2 試藥

受試制劑：鹽酸甲氯芬酯膠囊（湖南華納大藥廠有限公司，規格：每粒100mg，批號：20081206）；參比制劑：鹽酸甲氯芬酯膠囊（廣東先強藥業有限公司，每粒100mg，批號：20080902）；對氯苯氧乙酸對照品（廈門星隆達化工有限公司，含量：99.0%）；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為雙重蒸餾水?？瞻籽獫{由中南大學湘雅二醫院血液科提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：漢邦 C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30）；檢測波長：254nm；流速：1.0mL·min－1；進樣量：20μL；柱溫：25℃。

2.2 受試者選擇

健康男性志愿者18名，年齡（23.2±1.2）歲，身高（171.0±3.4）cm，體重（61.4±4.0）kg，試驗前進行體格檢查，血尿常規、肝腎功能、心率、血壓和心電圖等檢查均正常；試驗者既往體健，無藥物過敏史，無吸煙、嗜酒及經常用藥史。2周內未服用任何可能影響本品吸收、代謝的藥物。試驗期間統一清淡飲食，不使用除受試制劑和參比制劑以外的任何藥物，不接受煙、酒及含咖啡的飲料，避免劇烈運動。受試者試驗前簽署知情同意書，本試驗方案經湖南省腦科醫院醫學倫理委員會審核批準。

2.3 試驗方案

采用雙周期自身隨機交叉試驗設計。18名受試者隨機等分為2組，每組受試者每次試驗時分別服用鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑或參比制劑。受試者于試驗前1日晚餐后，禁食不禁水12h，次日清晨空腹分別單劑量口服含鹽酸甲氯芬酯200mg的受試制劑或參比制劑，以250mL溫開水送服，并作記錄。服藥2h后可自由飲水，服藥4h后進統一標準餐。試驗期間由醫護人員進行監護。間隔7d后交叉給藥，重復上述試驗。分別于服藥前0h和服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、14、24h時由前臂肘靜脈取血5mL。血樣置于肝素化的離心管中，立即離心（3000r·min－1）5min，分離出血漿，置－20℃冰箱中保存備用。

2.4 標準溶液的制備

準確稱取對氯苯氧乙酸對照品10mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1000μg·mL－1的對氯苯氧乙酸貯備液。用甲醇將此貯備液稀釋成濃度為100、10、1μg·mL－1的系列對照品溶液，均置于4℃冰箱中保存，備用。

2.5 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品0.2mL于離心管中，加入乙腈0.7mL，渦流混旋3min，以 16000r·min－1離心3min。取上清液20μL進樣分析。

2.6 專屬性考察

空白血漿、對氯苯氧乙酸對照品溶液、空白血漿+對氯苯氧乙酸對照品溶液以及健康受試者血漿樣品，經HPLC分析測定得到色譜圖見圖1。對氯苯氧乙酸保留時間約為4.1min，峰形良好，基線平穩，無雜峰干擾測定，表明本方法具有較高的特異性，能準確測定血漿中對氯苯氧乙酸的濃度。

2.7 標準曲線與定量下限

取離心管數支，分別精密加入不同量的對氯苯氧乙酸對照品溶液后以氮氣流吹干，加入空白血漿0.2mL，渦旋混勻1min，配成血漿中含對氯苯氧乙酸分別為0.047、0.141、0.47、1.41、4.70、14.1、28.2μg·mL－1的標準系列濃度，按“2.5”項下方法操作，每一濃度進行5樣本分析，進樣20μL，記錄色譜圖及對氯苯氧乙酸峰面積。以對氯苯氧乙酸峰面積平均值（A）對血藥濃度（c）進行回歸運算，得回歸方程為：A＝9.2886×c+0.3433（r＝0.9969），結果表明對氯苯氧乙酸血藥濃度在0.047～28.2μg·mL－1濃度范圍線性關系良好。定量下限為0.047μg·mL－1。

2.8 精密度及回收率試驗

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.對氯苯氧乙酸對照品溶液；C.空白血漿+對氯苯氧乙酸對照品溶液；D.受試者血漿樣品；1.對氯苯氧乙酸Fig1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.chlorophenoxyacetic acid standard solution；C.blank plasma+chlorophenoxyacetic acid standard solution；D.plasma sample of the subjects；1.chlorophenoxyacetic acid

取離心管數支，于離心管中精密加入不同量的對氯苯氧乙酸對照品溶液適量，以氮氣流吹干后，精密加入空白血漿0.2mL，渦旋混勻1min，配成含對氯苯氧乙酸0.141、1.41、4.1μg·mL－1的血漿，按“2.5”項下方法操作，每種濃度平行做15份樣品（3d 3批次），并與標準曲線同批進行測定，以當日的標準曲線計算對氯苯氧乙酸濃度，考察方法的準確度與精密度，結果表明其準確度與精密度符合藥動學研究的方法學要求。精密度及回收率試驗結果見表1。

表1 精密度及回收率試驗結果Tab1 Results of precision and recovery test

2.9 絕對回收率試驗

取離心管數支，分別取對氯苯氧乙酸對照品溶液適量于離心管中，用甲醇配成含對氯苯氧乙酸濃度分別為0.141、1.41、14.1μg·mL－1的溶液，每份0.2mL，以氮氣流吹干后，精密加入雙重蒸餾水0.2mL和乙腈0.7mL溶解殘渣，精密吸取20μL進樣分析，記錄色譜圖和峰面積（As）。另取離心管數支，于離心管中精密加入不同量的對氯苯氧乙酸溶液適量，以氮氣流吹干后，精密加入空白血漿0.2mL，渦旋混勻1min，配成含對氯苯氧乙酸濃度分別為0.141、1.41、14.1μg·mL－1的血漿樣品，每種濃度各做5份樣品，加入乙腈0.7mL，渦旋混勻3min，于16000r·min－1離心3min，精密吸取20μL上清液進樣分析，記錄色譜圖和峰面積（Ai）。對氯苯氧乙酸的絕對回收率＝Ai/As×100%。測定結果見表1。

2.10 穩定性試驗

取干凈離心管數支，按“2.7”項下方法制備含對氯苯氧乙酸濃度分別為0.141、1.41、14.1μg·mL－1的標準含藥血漿，每個濃度各平行制備5份，共15份，1份配制好后按“2.5”項下方法操作后，立即進樣分析；1份血樣室溫放置4h后提取操作；1份提取后于4℃自動進樣器放置10h后進樣分析；1份于冰箱中冷凍保存1個月后取出，解凍后提取操作；1份在1個月內反復凍融3次后提取操作。結果顯示上述考察條件下所有樣品的測定值與添加值的RSD均＜15%，說明分析測試過程中各個條件下的樣品均較為穩定。

2.11 數據處理

受試制劑與參比制劑的cmax和tmax均以實測值表示；AUC0～t以梯形法計算；AUC0～∞按公式計算：AUC0～∞＝AUC0～t+ct/λZ（t為最后一次可實測血藥濃度的采樣時間；ct為末次可測樣本藥物濃度；λZ為對數藥-時曲線末端直線部份求得的末端消除速率常數）；t1/2用公式t1/2＝0.693/λZ計算。以各個受試者服用受試制劑與參比制劑的AUC0～t按下式分別計算其相對生物利用度（F）值：F＝AUC受試制劑/AUC參比制劑×100% 。主要藥動學參數經對數轉換后以多因素方差分析（ANOVA）進行顯著性檢驗，然后用雙單側t檢驗和計算90%置信區間的統計分析方法來評價和判斷藥物間的生物等效性。藥動學基本參數的計算與統計學檢驗統計分析借助DAS Ver2.0軟件完成。

2.12 血藥濃度測定結果及藥動學參數

18名受試者口服鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑或參比制劑200mg后的平均藥-時曲線見圖2。受試者口服鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑或參比制劑200mg后的主要藥動學參數見表2。對同一受試者2種制劑的藥動學參數進行配對t檢驗，差異均無統計學意義（P＞0.05）。以參比制劑為標準對照，受試制劑的相對生物利用度為（100.7±11.7）%。

圖2 18名健康志愿者單劑量口服鹽酸甲氯芬酯受試制劑或參比制劑后的平均藥-時曲線Fig2 Mean plasma concentration-time curves of meclofenoxate hydrochloride in 18healthy volunteers after single oral dose of Meclofenoxate hydrochloride capsules

表2 18名健康志愿者單劑量口服鹽酸甲氯芬酯受試制劑或參比制劑后的主要藥動學參數Tab2 Main pharmacokinetic parameters of meclofenoxate hydrochloride in 18healthy volunteers after single oral dose of Meclofenoxate hydrochloride capsules

2.13 生物等效性評價

受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC經對數轉換后進行方差分析，并進一步采用雙單側t檢驗和（1－2α）置信區間法進行生物等效性評價，tmax采用非參數檢驗法。結果表明：對氯苯氧乙酸的 AUC0～t、AUC0～∞和ρmax均拒絕生物不等效假設（P＞0.05）；受試制劑的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區間分別為參比制劑相應參數的96.48%～122.90%、97.64%～111.99%和97.81%～111.73%；非參數檢驗結果顯示，2制劑的tmax差異無統計學意義（P＞0.05）。根據以上結果，判定2制劑生物等效。

2.14 不良反應或事件

整個試驗過程由經《藥物臨床試驗管理規范》（GCP）培訓的臨床醫師和護士進行觀察，18名受試者在服用含鹽酸甲氯芬酯200mg的受試制劑或參比制劑后均無不適主訴，亦未觀察到不良事件，且均按要求完成試驗。

3 討論

本文建立了測定人血漿中對氯苯氧乙酸濃度的HPLC法，預處理簡單、快速，血樣干擾少。線性關系和樣品穩定性均良好，其方法的精密度和準確度均能符合藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導原則對生物樣品分析的要求，測定結果可靠。

國外有關鹽酸甲氯芬酯藥動學的研究未見報道，國內有采用毛細管電泳-電化學檢測法間接測定人血漿中鹽酸甲氯芬酯的報道[10]。18名試驗者單劑量口服鹽酸甲氯芬酯膠囊200mg的受試制劑或參比制劑后，AUC0～t的個體間差異較大，但制劑間、周期間差異無統計學意義。

由于該試驗的研究對象均為健康男性，且為單劑量給藥，人群范圍太窄，年齡均較年輕化，故結果不能代表和推斷出老年人群的給藥指數。

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[5] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，482：1.

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Bioequivalence Study of Meclofenoxate Hydrochloride Capsule in Healthy Volunteers

HUA Ka
（Dept.of Pharmacy，Hunan Provincial Brain Hospital，Changsha 410007，China）
LI Jian-he，ZHU Yun-gui，YI Li-dan，LIU Xiao-lei，YANG Qiao-feng，ZENG Xiao-hui，LUO Xia
（Dept.of Pharmacy，The Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410011，China）
CAO Jun-hua
（Mawangdui Hospital of Hunan Province，Changsha 411016，China）

OBJECTIVE：To evaluate the bioequivalence of two kinds of Meclofenoxate hydrochloride capsule in Chinese healthy volunteers.METHODS：18healthy male volunteers were randomly divided into 2groups and given single oral dose of meclofenoxate test preparation or reference preparation 200mg.The blood samples were collected at 0h，and 0.33，0.67，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，14，24h after adiministrotion.The concentration of chlorophenoxyacetic acid in plasma was determined by HPLC.The pharmacokinetic parameters were calculated and the relative bioequivalence was evaluated by DAS Ver 2.0software.RESULTS：The main pharmacokinetic parameters of trial capsules vs.reference capsule of meclofenoxate hydrochloride were as follows：tmax（2.11±0.37）h vs.（2.06±0.34）h；cmax（12.56±2.85）μg·mL－1vs.（12.78±2.84）μg·mL－1，t1/2（5.81±2.68）h vs.（6.00±2.14）h；AUC0～24（34.11±7.89）μg·h·mL－1vs.（34.12±7.99）μg·h·mL－1；AUC0～∞（34.83±7.68）μg·h·mL－1vs.（34.79±7.97）μg·h·mL－1，respectively。The relative bioavailability of test capsule was（100.7±11.7）%.CONCLUSION：Two kinds of meclofenoxate hydrochloride capsules are bioequivalent in Chinese healthy volunteers.

Meclofenoxate hydrochloride capsule；Chlorophenoxyacetic acid；HPLC；Bioequivalence

R969.1；R971+.7

A

1001-0408（2011）18-1669-04

＊副主任藥師。研究方向：醫院藥學。電話：0731-85232243。E-mail：hkcsy2008@126.com

#通訊作者：副主任藥師，碩士。研究方向：新藥研發。電話：0731-85292093。E-mail：lijianhexy@126.com

2010-08-09

2010-10-30）