福建省腸道病毒71型分離株(2010FJLY008)全基因組核苷酸序列分析＊

陳 煒,周朝暉,沈曉娜,2,張擁軍,謝劍鋒,吳冰珊,王金章,翁育偉,鄭奎城,嚴延生

腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)為小RNA病毒科腸道病毒屬成員,是引起患者手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原體。

自1997年開始,由 EV71病毒引起的手足口病暴發公共衛生事件在東亞及東南亞逐漸增多,并經常引起社會恐慌,例如1997年的馬來西亞及1998年中國臺灣的手足口病暴發[1-2]。2008年我國安徽省阜陽市等地區出現了主要由EV71病毒引起的手足口病暴發流行,同年5月份我國將手足口病納入丙類法定傳染病進行管理。而2010年手足口病疫情的防控形勢更加嚴峻,截止9月份,監測結果顯示,無論是福建省還是全國,手足口病發病率、重癥病例發生率、死亡率,均明顯高于前兩年的同期水平。為了解腸道病毒71型在福建省的遺傳背景,追蹤EV71流行過程中可能發生的變異,為今后福建省及國內手足口病疫情防控提供理論基礎,我們對從福建省一名手足口病患兒標本分離到的EV71型分離株(2010FJL Y008)進行了全基因組核苷酸序列測定及分析,結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 腸道病毒 71型分離株(2010FJL Y008)由本實驗室通過接種2010年福建龍巖地區一位3歲手足口病男患兒咽拭子標本于RD細胞,分離兩代收獲,具體方法及結果判定見文獻[3]。

1.1.2 試劑 AMV逆轉錄酶購于Promega公司;隨機引物、TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制劑購于Takara公司;病毒核酸提取試劑盒、膠回收試劑盒購于QIA GEN公司(德國);質粒提取試劑盒購于TIANGEN公司 (北京)。pMDTM18-T載體與DH5α感受態細胞均購于 Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取 采用QIAamp viral RNA mini kit提取病毒RNA,按照試劑盒說明書進行操作。從140μL的第二代細胞培養物上清液獲得50μL的總RNA溶液。

1.2.2 cDNA的制備 以提取的RNA為模板,按照AMV逆轉錄酶使用說明書操作,加入AMV逆轉錄酶和隨機引物,37℃1h,合成病毒基因組的cDNA。

1.2.3 病毒基因組的克隆 以病毒基因組的cDNA為模板,在 TaqDNA聚合酶作用下,根據文獻所用引物[4],分8個特異性片段擴增病毒基因組。PCR反應條件:94℃3min;94℃1min,50℃1min,72℃90sec,34個循環;72℃10min。PCR擴增的8個片段經1%瓊脂糖凝膠電泳分離,用 QIAquick Gel Extraction Kit回收純化后,分別克隆至pMDTM18-T載體。重組克隆經RV-M和M13-47通用引物鑒定。

1.2.4 DNA序列測定和分析 提取的陽性重組克隆質粒送 Takara公司測序。全部核苷酸和氨基酸序列分析和同源性比較應用DNASTAR軟件完成,系統發生樹構建應用Mega 4.0軟件完成。所有參考序列均來自 GenBank,見表1。

表1 序列分析中所用CoxA16和EV71毒株信息Table Background of CoxA16 and EV71 strains in sequence analysis

2 結 果

2.1 病毒全基因組片段的擴增、克隆與鑒定 從RD細胞培養上清液提取RNA,用隨機引物做逆轉錄,得到覆蓋腸道病毒71型分離株(2010FJL Y008)全長的cDNA片段,以此為模板,利用覆蓋全基因組(除了多聚腺甘酸尾,即polyA尾)的8對引物進行PCR反應,1%瓊脂糖凝膠電泳分離,得到7個1～1.4kb片段及一個近200bp的片段。8個片段經過回收純化后分別克隆至pMDTM18-T載體。重組克隆經RV-M和M13-47通用引物鑒定,陽性質粒用于測序分析。

2.2 2010FJL Y008株全基因組核苷酸序列測定分析 經過序列測定、拼接、比對及分析后,獲得腸道病毒71型分離株(2010FJL Y008)的全基因組核苷酸序列(未包括polyA尾),全長7 403bp,其中A占27.11%,G占23.94%,C占24.33%,U占24.63%,腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸較豐富(A+U=51.74%)。腸道病毒 71型分離株(2010FJL Y008)5′端的非編碼區(5′U TR)長 740 個堿基,5′U TR之后是6582個堿基的病毒基因組開放讀碼框(ORF),編碼一個2193個氨基酸的多聚蛋白,3′端的非編碼區(3′U TR)長81個堿基。與其他EV71毒株相比,2010FJL Y008株在編碼區沒有核苷酸的缺失與插入,但在5′U TR與3′U TR區有核苷酸的缺失和插入存在。2010FJL Y008株全基因組的組成和結構符合 EV71型腸道病毒的特征,見表2。

2.3 基因組核苷酸序列同源性比較 將2010FJL Y008株與來自 GenBank的其他 CA16、EV71型毒株進行核苷酸序列同源性比較。從表3可以看出,無論是全長基因組,還是在5′U TR、P1、P2、P3、3′U TR各個分區中 ,2010FJL Y008 株與2008年安徽阜陽流行株 Fuyang17.08-2的同源性均最高;在全長基因組及 5′U TR、P1區中,2010FJL Y008株與CA16,G-10的同源性最低;在P2區,2010FJL Y008株與BrCr株同源性最低;在P3、3′U TR 區 ,2010FJL Y008株與 TW2272同源性最低。

表2 2010FJLY008株基因組核苷酸及編碼區氨基酸數目Table 2 Nucleotide andamino acid numbers in coding regions of 2010FJLY008

表3 2010FJLY008株與其他CA16、EV71型毒株核苷酸序列同源性比較(%)Table 3 Comparison of nucleotide sequence homology among 2010FJLY008 and other CA16 and EV71 strains(%)

2.4 編碼蛋白氨基酸序列同源性比較2010FJL Y008株病毒基因組編碼區全長6582個核苷酸,共編碼2 193個氨基酸。將2010FJL Y008株與其他CA16、EV71型毒株氨基酸序列進行同源性比較,見表4。從編碼的氨基酸組成成分分析,2010FJL Y008株與 Fuyang17.08-2株在 P1、P2、P3的同源性均最高;在 P1區,2010FJL Y008株與CA16,G-10株同源性最低;在 P2、P3區,2010FJL Y008株與 TW2272株同源性最低。從編碼的結構蛋白分析,在 VP1、VP2及 VP4區,2010FJL Y008株與 Fuyang17.08-2株的同源性最高,其中在 VP2、VP4區同源性為 100%;在 VP3區,2010FJL Y008株與 SHZH03的同源性最高;在VP1、VP2、VP3及 VP4區,2010FJL Y008株與CA16,G-10的同源性均最低。

2.5 病毒基因的遺傳進化分析 使用Mega 4.0軟件,通過鄰接法(Neighbor-joining),基于全長VP1基因,以 CA16,G-10為外群,對2010FJL Y008株與其它24株已知基因型的 EV71毒株進行遺傳進化分析(圖 1)。可以看出,2010FJL Y008株與Fuyang17.08-2株進化關系最近,同屬于C4基因亞型的C4a進化分支;同時,以CA16,G-10為外群,對2010FJL Y008株與其它來自不同地區和年代的共11株EV71毒株的全長基因組核苷酸序列進行遺傳進化分析(圖2)。同樣可以看出,2010FJL Y008株與 Fuyang17.08-2株的親緣關系最密切,而2008、2009年以來國內不同省市分離到的 EV71毒株無論在VP1還是在全基因組核苷酸水平均存在密切聯系,而與國外一些EV71毒株存在較大差異。

表4 2010FJLY008與其他CA16、EV71型毒株氨基酸序列同源性比較(%)Table 4 Comparison of amino acid sequence homology among 2010FJLY008 and other CA16 and EV71 strains of(%)

圖1 lEV71病毒VP1區的遺傳進化分析Fig.1 Phylogenetic tree of VP1 regions in EV71 viruses

3 討 論

2010FJL Y008株是2010年在福建省龍巖地區手足口病患兒(普通病例)的咽拭子標本中分離的毒株,經過Real-time RT-PCR鑒定為 EV71型毒株。病毒全基因組序列分析表明,2010FJL Y008株與其它EV71型毒株一樣,具有相同的基因組結構。2010FJL Y008株全長7403bp(未包括polyA尾),僅有一個開放編碼框(ORF),位于全基因組的第741-7322位核苷酸,編碼2193個氨基酸的多聚蛋白,該多聚蛋白可進一步被水解成 P1、P2、P3三個前體蛋白,P1前體蛋白編碼 VP4、VP2、VP3、VP1四個病毒外殼蛋白,P2、P3前體蛋白主要編碼蛋白水解酶及RNA聚合酶,在編碼區的兩端分別有740個核苷酸的5′U TR及81個核苷酸的3′U TR。

圖2 EV71病毒全長基因組核苷酸序列的遺傳進化分析Fig.2 Phylogenetic tree of genomic nucleotide sequences in EV71 viruses

基因組核苷酸序列同源性比較及編碼氨基酸序列同源性比較顯示:2010FJL Y008株與EV71標準株BrCr相比,核苷酸變異為20.2%,氨基酸變異為5.1%;而與2008年阜陽流行株(Fuyang17.08-2)相比,核苷酸及氨基酸變異分別只有1.8%、0.5%;2010FJL Y008株在 5′U TR與 3′U TR區有核苷酸的缺失和插入存在,在編碼區沒有核苷酸的缺失和插入。

雖然目前還沒有確切證據表明EV71的毒力或感染結局與基因組的任何特異位點有關,大部分研究都集中在 EV71病毒的VP1區。Obereste等在HEV71病毒的VP1區分子進化研究及其應用于分類小RNA病毒中指出:VP1區編碼蛋白含有大量的病毒中和因子,全長VP1區核苷酸序列分析,可作為腸道病毒屬內不同血清型分類的依據,也可以作為小RNA病毒科內不同屬的分類參考[5]。基于全長VP1區核苷酸序列進行遺傳進化分析被公認為是進行 EV71基因型鑒定方法。根據Brown等[6]關于EV71病毒分子流行病學及進化研究,他對1970年至1998年在美國及其他5個國家分離的113株 EV71型毒株的全長VP1區基因進行了分析,把所有的 EV71分為A、B、C三個基因型。本實驗通過對全長 VP1區基因的遺傳進化分析,2010FJL Y008株與 Fuyang17.08-2株的親緣關系密切,包括 SHZH03在內同屬于 C4基因亞型的C4a進化分支。楊秀惠等[7]在2008年對我省福州、泉州及龍巖地區的8株 EV71進行全長VP1區基因種系發生分析,2008年福建與阜陽分離株和中國大陸1998年以來的病毒株均為 C4亞型。因此,與2008年相比,2010年福建省的流行株(2010FJL Y008)的基因型并未發生變異,未產生明顯抗原漂移及變異,仍然與2008年阜陽分離株一樣,為C4基因亞型。同時,全長基因組核苷酸序列的遺傳進化分析,2010年福建省的流行株(2010FJL Y008)與2008年阜陽流行株(Fuyang17.08-2)的親緣關系同樣接近。另外,通過全長基因組核苷酸序列的遺傳進化分析,我們發現,EV71株與CA16株依然各自形成一個分支。而在EV71株的分支中,基于VP1區核苷酸序列遺傳進化分析認為是B基因型的毒株(USA7423)與A基因型毒株(BrCr)存在較近的進化關系。

總之,2010年福建省 EV71型病毒流行株(2010FJL Y008)在病毒全基因組結構、基因組核苷酸同源性比較、氨基酸同源性比較、全長基因組核苷酸序列遺傳進化分析及VP1區基因遺傳進化分析等方面,均與2008年阜陽流行株(Fuyang17.08-2)關系密切。但是,隨著對手足口病診療水平及重視程度的提高,2010年福建省乃至中國大陸,由EV71型病毒引起的手足口病發病率、重癥率、死亡率均明顯高于2008、2009年,盡管全基因組進化分析顯示近幾年國內不同地區的 EV71分離株聯系緊密,是否存在病毒基因組未知位點的變異導致病毒致病能力的變化,依然缺乏證據。因此,今后手足口病的監測工作不能有絲毫松懈,需要進一步開展病毒基因片段核酸序列分析,追蹤病毒在流行過程中發生的任何遺傳變異,為 EV71疫苗研制和有效控制手足口病奠定基礎。

[1]Shih S R,Ho M S,Lin K H,et al.Genetic analysis of enterovirus 71isolated from fatal and non-fatal cases of hand,foot and mouth disease during an epidemic in Taiwan,1998[J].Virus Research,2000,68(2):127-136.

[2]AbuBakar S,Chee H Y,Al-Kobaisi M F,et al.Identification of enterovirus 71 isolates from an outbreak of hand,foot and mouth disease(HFMD)with fatal cases of encephalomyelitis in Malaysia[J].Virus Research,1999,61(1):1-9.

[3]國家脊髓灰質炎和國家麻疹實驗室.手足口病實驗室手冊[R].4版.北京:中國疾病預防控制中心,2010:20-26.

[4]周世力,李琳琳,何雅青,等.我國分離的腸道病毒 71型(SHZH03)病毒株全基因組核苷酸序列分析[J].病毒學報,2004,20(1):7-11.

[5]Obereste M S,Maher K,Kilpatrick D R,et al.Molecular evolution of the human enteroviruses:correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classi cation[J].J Virol,1999,73(3):1941-1948.

[6]Brown BA,Oberste M S,Alexander J P,et al.Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998[J].J Virol,1999,73(12):9969-9975.

[7]楊秀惠,嚴延生,周勇,等.2008年福建省腸道病毒71型分離株的遺傳特征分析[J].海峽預防醫學雜志,2009,15(6):4-7.