賴氨肌醇維B12口服溶液中賴氨酸與維生素B12含量測定

謝清春 呂竹芬

（廣東藥學院藥物研究所，廣東廣州510006）

氨基酸是人體生命活動過程中不可缺少的一種物質，賴氨酸又是人體不能自身合成而又為機體所必須的8種氨基酸中最為重要的一種。賴氨酸可加快神經細胞代謝過程，提高腦組織的生理功能，增強記憶力[1]。維生素B12是人體內非常重要的水溶性維生素之一[2]，維生素B12缺乏時，從甲基四氫葉酸上轉移甲基基團的活動減少，使葉酸變成不能利用的形式，導致兒童發育和神經功能受損等。營養性貧血目前仍為我國兒童時期的多發病，其發病率占兒科門診的40%左右。補充賴氨酸維生素B12口服溶液可增進小兒食欲[3]，補充機體必需營養，改善小兒免疫功能。因此對賴氨肌醇維B12口服溶液進行質量標準研究對控制賴氨肌醇維B12口服溶的質量有著重要的意義。

1 儀器與試藥

821型袖珍數字式pH離子計（中山大學電子廠），Dionex P680高 效 液 相 色 譜 儀，DiamonsilTMC18（5μm，250mm×4.6mm）色譜柱，混合磷酸鹽pH緩沖劑（上海虹北試劑廠），氫氧化鈉（AR，廣州化學試劑廠），甲醛溶液（AR，廣州化學試劑廠）。

鹽酸賴氨酸對照品（色譜純，上海康達氨基酸廠，批號：20020311），維生素B12對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100248-200201），自制賴氨肌醇維B12口服溶液（批號：20050608、20050610、20050612）。

2 方法與結果

2.1 鹽酸賴氨酸含量測定

2.1.1 測定方法 按照賴氨肌醇維B12口服溶液標準[WS-10001-（HD-0482）-2002]中含量測定方法測定[4]。方法為：精密量取本品15mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取20mL，用NaOH滴定液（0.1mol/L）調節pH至7.0，然后加預先校正至pH=9.0的甲醛溶液14mL，再以NaOH滴定液滴定至pH為9.0，自加入甲醛溶液以后所消耗的NaOH滴定液（0.1mol/L）的每1毫升數即為賴氨酸所消耗的毫升數。每1毫升的NaOH滴定液相當于9.132mg的C6H14N2O2·HCl。

2.1.2 工作曲線的制定 精密稱取鹽酸賴氨酸對照品1.8g，置于200mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取16、18、20、22、24mL，照1.1項下的“用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）調節pH至7.0”開始操作測定，計算V（滴定液消耗量/mL）對G（鹽酸賴氨酸的量/mg）的回歸方程為V=0.1055G-0.3425，r=0.9996。

2.1.3 精密度實驗 取批號為20050608的樣品，精密量取6份，分別按1.1項下的方法測定其含量，測定結果為100.44%、101.15%、101.71%、101.31%、100.88%、100.76%，RSD% 為0.44%（n=6），精密度試驗良好。

2.1.4 溶液穩定性試驗 取批號為20050608的樣品，于0、2、8、24、48、120h分別按1.1項下的方法測定其含量，結果分別為 101.12%、100.53%、102.15%、100.79%、101.55%、101.65%，RSD%為0.59%（n=6），溶液穩定性好。

2.1.5 回收率試驗 按處方比例配制不含鹽酸賴氨酸的陰性溶液，精密稱取鹽酸賴氨酸對照品0.72g、0.9g和1.08g（相當于含量的80%、100%和120%）置100mL量瓶中，加入陰性溶液到刻度，搖勻，照1.1項下方法測定。結果見表1，平均回收率為99.81%，RSD=0.46%，符合含量測定要求。

表1 鹽酸賴氨酸含量測定的回收率試驗

2.1.6 樣品含量測定 精密量取本品15mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取20mL，照1.1項測定三批自制樣品，結果表明自制三批樣品（20050608、20050608、20050610）中鹽酸賴氨酸含量分別為100.72%、99.45%和99.76%，均符合規定。

2.2 維生素B12的含量測定方法

2.2.1 對照液和供試液的配制 對照品溶液：精密稱取維生素B12對照品10mg，置50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻得到濃度為200μg/mL標準儲備液，精密量取此溶液3mL至200mL容量瓶中，加水稀釋至刻度即得濃度為3μg/mL對照液。供試品溶液：取本口服液用0.45μm濾過，即得。

2.2.2 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉（16︰84）用磷酸調節pH=3.3為流動相，流速1mL/min，檢測波長210nm。取維生素B12對照品溶液過0.45um濾膜濾后，精密量取續濾液20uL注入液相色譜議，記錄色譜圖。維生素B12的理論塔板數應大于800，不含維生素的B12的陰性對照對測定沒有干擾。見圖 1、2、3。

圖1 標準品HPLC圖

圖2 樣品HPLC圖

圖3 陰性對照HPLC圖

2.2.3 線性關系考察 取維生素B12對照品適量用水制成每1mL 含 100μg的溶液的標準貯備液，依次吸取 0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于50mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾，精密量取續濾液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，計算回歸方程為A=0.8407C-0.0425，r=0.9998（n=6）。

2.2.4 精密度試驗 取本品供試液20μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，分別記錄色譜圖，計算進樣的精密度，結果峰面積分別為2.422、2.414、2.432mAU×min，其RSD為0.99%，表明方法精密良好。2.2.5 溶液穩定性試驗 取本品在室溫下放置，定時取樣測定，結果在 0、2、6、8、10、18、24h 峰面積分別為 2.453、2.471、2.434、2.475、2.405，2.435mAU×min，其 RSD 為 1.08%，表明溶液在24h內穩定。

2.2.6 最低檢出限與定量限 按信噪比為3計算得最低檢出限為0.12μg/mL，按10倍信噪比計算得最低定量限為0.40μg/mL。

2.2.7 回收率試驗 按處方配比將維生素B12配制成2.4，3.0，3.6μg/mL三個濃度的溶液各100mL各3份，分別進樣測定，結果見表2，平均回收率為98.80%，RSD為0.92%。

表2 維生素B12的回收率試驗

2.2.8 樣品測定 取本品適量，用0.45μm濾過，取續濾液備用照含量測定基下依法測定，按外標法以峰面積計算，結果20050608、20050610、20050612 含 量 分 別 為 100.81%、99.43%和98.25%，均符合規定。

3 討論

原口服液標準中無維生素B12的含量測定，本文中的經驗證表明可以用于本口服液的含量測定，可以進一步本品的質量。本文曾嘗試衍生后用高效液相色譜法測定本品中肌醇的含量，但經多次試驗表明衍生的結里重現不好，無法應用于肌醇的測定。本品中的鹽酸賴氨酸無紫外吸收，尚不能通過高效液相的紫外檢測法同時測定本品中鹽酸賴氨酸與維生素B12。

[1] 陸志范，周全保 . 賴氨酸的藥用功能[J]. 藥學實踐雜志，1966，14（4）：255.

[2] Weiss R，Fogelman Y，Bennett M. Severe vitamin B12 deficiency in an infant associated with a maternal deficiency and a strict vegetarian diet[J].J Pediatr Hematol Oncol，2004，26（4）：270-271.

[3] 王華芳，王招定，周海燕. 同笑口服液對小兒生長發育及免疫功能的影響[J]. 浙江醫學，2006，28（10）：872-873.

[4] 國家藥典委員會.國家藥品監督管理局國家藥品標準化學藥品地方標準上升國國家標準第五冊[S].2002：267.