星點設計-效應面法優化白茅根總酚酸提取工藝

劉榮華，陳石生，任剛，邵峰，黃慧蓮，楊明

(江西中醫學院現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌330004)

白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindricaBeauv.Var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根莖，又名蘭根、地筋、白花茅根、茅草根、甜草根等，廣泛分布于全國各地，具有涼血止血、清熱生津、利尿通淋之功效［1］。白茅根酚酸類成分主要有tricin、jaceidin、quercetagetin-3，5，6，3＇-tetramethyl ether、3，5-Di-O-methyl-kaempferol、3-hydroxy-4-methoxy benzaldehyde、impecyloside、cylindol A B、graminones A B、imperanene、5-hydroxy-2-(2-phenylethyl)chromone、5-hydroxy-2-styrylchromone、5-hydroxy-2-［2-(2-hydroxyphenyl)ethyl］chromone、flidersiachromone［2-7］。藥理研究顯示白茅根中酚酸類成分具有血管舒張、血小板聚集抑制活性、抗氧化活性、細胞毒性、p-糖蛋白抑制活性、糖原磷酸化酶A抑制活性、抗炎活性、抗HBV病毒復制、神經保護作用等生物活性［8-10］。因此，有必要對白茅根中酚酸類成分的提取工藝進行研究。

本研究采用超聲波輔助提取法(Ultrasound-associated extraction，UAE)，在單因素考察的基礎上利用星點設計(central composite design，CCD)，通過三維效應面(three dimensional response surface)進行數據處理與擬合，優化白茅根總酚酸的提取工藝，為白茅根中酚酸類成分的提取提供了依據。

1 材料

KQ-300DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-2550型紫外分光光度計(日本Shimadzu公司);R-210型旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司);Sartorious BT 124S型萬分之一天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);GZX-9070MBE型數顯鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);高速中藥粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司);S-4藥典檢驗篩(浙江上虞市華康化驗儀器廠)。

白茅根于2010年3月采于江西中醫學院灣里校區，經江西中醫學院賴學文教授鑒定為禾本科植物白茅Imperata cylindricaBeauv.Var.major(Nees)C.E.Hubb.的根莖，憑證標本存于江西中醫學院標本館。

沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110831-200803)，鐵氰化鉀、三氯化鐵、鹽酸、無水乙醇均為分析純，雙蒸水自制。

2 方法與結果

2.1 白茅根總酚酸的測定

2.1.1 材料的處理將采挖的新鮮白茅根洗凈處理后置烘箱中60℃恒溫干燥，后用粉碎機粉碎，過藥典四號篩，－20℃冷凍保存備用。

2.1.2 標準曲線的制備參考文獻［11］，并作改進，精密吸取19.70 μg/mL沒食子酸標準品溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、2.80 mL于25 mL量瓶中，加入新鮮配制的0.10 mol/L三氯化鐵-0.008 0 mol/L鐵氰化鉀(1∶1)混合液1 mL，搖勻，暗處放置5 min，再用0.10 mol/L鹽酸定容至刻度，搖勻，暗處放置20 min，在波長695 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標y，沒食子酸質量濃度x(μg/mL)為橫坐標，得回歸方程為:y=0.291 1x+0.054 9，R2=0.998 5，線性范圍為0.039 33～2.200 8 μg/mL。

2.1.3 白茅根總酚酸的測定準確稱取白茅根粉末2.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，在一定料液比、溶劑濃度、溫度條件下超聲波輔助提取一定時間，取出過濾，濾液在40℃下減壓干燥，用適量60%乙醇分次溶解，定容至10 mL，取提取液0.3 mL，用60%乙醇定容至10 mL即得供試品溶液，取0.5 mL供試品溶液于10 mL量瓶中，按2.1.2項下方法測定吸光度，計算總酚酸量。每個實驗重復做3次，取平均

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇對白茅根總酚酸提取效果的影響準確稱取2.0 g白茅根干粉6份，置于100 mL平底燒瓶中，按料液比1∶20，分別加入30%、40%、50%、60%、70%、90%的乙醇，在40℃下超聲提取40 min，提取液按2.1.3項下方法處理并測定溶液中總酚酸，結果如圖1所示。

從圖1可以看出，低濃度乙醇提取時，總酚酸隨著乙醇質量濃度的升高而增加，當乙醇為50%時，總酚酸達到最大值，乙醇大于60%后，總酚酸明顯降低并處于相對平穩狀態。因此，選擇50%作為白茅根總酚酸提取的最佳乙醇質量濃度。

圖1 乙醇濃度對總酚酸提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction of total phenolics

2.2.2 提取時間對白茅根總酚酸提取效果的影響

按料液比1∶20，加入70%的乙醇，在40℃下分別超聲提取20、30、40、50、60、90 min，提取液按2.1.3項下方法處理并測定溶液中總酚酸，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，提取時間為40 min時白茅根總酚酸的質量分數最高，因此，選擇40 min作為白茅根總酚酸的最佳提取時間。

圖2 提取時間對總酚酸提取效果的影響Fig.2 Effect of extracting time on extraction of total phenolics

2.2.3 提取溫度對白茅根總酚酸提取效果的影響

按料液比1∶20，加入70%的乙醇，分別在20、30、40、50、60、70℃下超聲提取40 min，提取液按2.1.3項下方法處理并測定溶液中總酚酸，結果如圖3所示。

從圖3可以看出，在提取溫度為20℃時可得到較高的白茅根總酚酸，其后總酚酸隨著溫度的升高而下降，當溫度為50℃時降到最低，而后又有所上升。考慮到酚酸類物質在較高溫度下易被破壞，故選擇20℃作為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對總酚酸提取效果的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on extraction of total phenolics

2.2.4 料液比對白茅根總酚酸提取效果的影響原料按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入70%乙醇，在40℃條件下超聲提取40 min，提取液按2.1.3項下方法處理并測定溶液中總酚酸。結果如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著料液比的增加，總酚酸顯著增加，達到1∶40后再增大料液比時，總酚酸反而降低，過大的溶劑用量會造成浪費，并給一些后續工作如:過濾、濃縮等帶來麻煩，因此選擇料液比為1∶40。

圖4 料液比對總酚酸提取效果的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction of total phenolics

2.3 星點設計試驗

2.3.1 因素、水平及指標的確定在單因素試驗結果的基礎上，料液比固定用1∶40，選取乙醇質量濃度、提取時間、提取溫度作為考察對象，采用Design Expert 7.0統計分析軟件，以總酚酸為響應值，進行效應面法優化試驗，以獲取最佳參數。試驗因素和水平安排見表1。

2.3.2 表2進行提取，按照2.1.3項下處理方法及2.1.2項下測定方法，測定白茅根總酚酸的質量分數，結果見表2。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

表2 星點試驗設計與結果Tab.2 The plan and results for response surface methodology

2.3.3 模型的建立及其顯著性檢驗利用Design Expert 7.0統計軟件通過逐步回歸表2實驗數據進行回歸擬合，得到總酚酸對以上3個因素的二次多項回歸方程為:

Y=2.646－0.386 81A+0.180 77B+0.359 54C+0.001 739 13AB－0.000 436 625AC－0.000 250 625BC+0.003 239 9A2－0.003 201 09B2－0.005 061 59C2

對該模型進行方差分析，結果見表3。表3顯示模型具有高度的顯著性(P＜0.01)，失擬項不顯著以及R2=0.887 6，可知方程擬合度和可信度均良好，試驗誤差小，故可用此模型對白茅根總酚酸的提取工藝進行分析和預測。

2.3.4 應曲面圖，考察所擬合的響應曲面形狀，分析乙醇質量濃度、提取時間和提取溫度對白茅根總酚酸的影響。其響應面圖見圖5～7，3組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of mean square deviation of regress equation

圖5 乙醇質量濃度、提取時間及其相互作用對總酚酸影響的響應面圖Fig.5 Correlative effects of ethanol concentration and time

圖6 乙醇質量濃度、提取溫度及其相互作用對總酚酸影響的響應面圖Fig.6 Correlative effects of ethanol concentration and temperature

比較3組圖并結合表3中p可知:C的一次項、AB、A2、B2、C2對總酚酸影響顯著，表明各影響因素對總酚酸得率的影響不是簡單的線性關系。

圖7 提取時間、提取溫度及其相互作用對總酚酸影響的響應面圖Fig.7 Correlative effects of extracting time and temperature

為進一步確定最佳提取工藝參數，基于已建立的數學模型，對總酚酸進行最優化設計，得到白茅根中總酚酸的提取條件為:乙醇濃度為40%，提取時間38 min，提取溫度為33℃，料液比為1∶40。白茅根總酚酸的預測值為2.71 mg/g。

2.3.5 驗證試驗為檢驗實驗方法的可靠性，在優化條件下，進行3次平行試驗驗證，得到白茅根總酚酸的質量分數為2.46 mg/g，與預測值接近，說明此模型可靠。因此，基于星點設計所得的最佳工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3 討論

超聲波輔助提取法(UAE)是采用超聲波輔助溶劑進行提取，聲波產生高速、強烈的空化效應和攪拌作用，破壞植物藥材的細胞，使溶劑滲透到藥材細胞中，縮短提取時間，提高提取率。該法所需設備簡單，操作方便，比一般提取技術更加有效，超聲過程中所需提取溫度較低，故可以防止目標成分可能的化學降解［12］，而溫度過高會加速酚性成分的氧化分解，所以UAE更加適合酚酸類成分的提取。

星點設計(CCD)是在析因設計的基礎上，加上星點及中心點而形成的實驗次數較少、可采用三維效應面(three dimensional response surface)進行數據處理與擬合的實驗設計方法［13］，已在藥物提取和處方工藝的優化中有一定的應用［14-16］。本實驗在單因素試驗的基礎上，利用星點設計-效應面法優化白茅根總酚酸的提取工藝，可為白茅根中酚酸類成分的提取提供依據，這對于進一步研究白茅根酚酸類成分具有重要意義。

由單因素試驗和星點試驗設計及其分析結果獲得的超聲輔助提取白茅根總酚酸的最佳工藝為乙醇濃度為40%，提取時間38 min，提取溫度為33℃，料液比為1∶40。該工藝總酚酸的預測值的質量分數為2.71 mg/g，驗證實驗總酚酸的質量分數為2.46 mg/g。本研究結果是在實驗室小試基礎上獲得的，還有待在放大實驗中進一步驗證。

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