熱痹消顆粒提取純化工藝研究

王寧，陳曉斌，劉志輝，劉漢清*

(1.南京中醫藥大學，江蘇南京210046;2.南京中醫藥大學一附院，江蘇南京210036)

熱痹消顆粒由粉萆薢、黃柏、景天三七等八味藥組成，具有清熱解毒、泄濁通絡、消腫定痛的功效，臨床用于急性痛風性關節炎、高尿酸血癥及痛風性腎病等疾病。為建立科學合理的提取純化工藝，本研究采用正交試驗考察醇提黃柏時回流提取時間、提取次數、乙醇濃度對小檗堿含量的影響［1］，優選出黃柏提取工藝條件;考察水提粉萆薢等七味時加水倍量、提取時間、提取次數對虎杖苷含量和干膏得率的影響［2-3］，優選出最佳水提工藝條件;并通過對醇沉工藝的優選確立熱痹消顆粒的提取純化工藝。

1 儀器和試藥

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);十萬分之一電子分析天平(德國SARTOIUS，型號BP211D);鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:0713-9906)、虎杖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:090318);甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純;粉萆薢等飲片均購自安徽協和成藥業飲片有限公司，符合中國藥典2010版一部要求。

2 方法和結果

2.1 工藝路線根據熱痹消各味藥所含成分的特點，確定制備工藝為:黃柏:醇提→合并濾液→回收乙醇→浸膏Ⅰ;黃柏藥渣與其余七味:水提→合并濾液→濾過→濃縮至清膏→醇沉→靜置24 h→回收乙醇→浸膏Ⅱ;混合浸膏Ⅰ和浸膏Ⅱ→加入輔料→制粒。

2.2 黃柏醇提工藝優選

2.2.1 正交試驗設計選定提取時間、提取次數、乙醇濃度作為考察因素，以鹽酸小檗堿為指標性成分［4-6］，選用L9(34)正交表設計實驗。見表1。

表1 因素與水平

2.2.2 黃柏的提取稱取黃柏飲片9份，每份50 g，加入10倍量的乙醇，按正交試驗表回流提取，過濾，合并濾液，備用。

2.2.3 鹽酸小檗堿測定

2.2.3.1 色譜條件與系統適應性實驗［7］色譜柱:Hedera-ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－0.448%磷酸二氫鉀(35∶65);體積流量:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:265 nm。理論塔板數按鹽酸小檗堿峰計算不低于4 000。

2.2.3.2 對照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿4.98 mg，置25 mL的量瓶中，甲醇定容，精密量取5 mL，置25 mL的量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得(鹽酸小檗堿質量濃度0.039 8 mg/mL)。

2.2.3.3 供試品溶液的制備精密吸取黃柏醇提取液1 mL至25 mL的量瓶中，甲醇定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3.4 線性關系考察精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液3、5、10、15、25、35 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為:Y=31 635X－16.604，r=0.999 8。結果表明，鹽酸小檗堿在0.119 4～1.393 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.3.5 測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定即得。計算，鹽酸小檗堿質量分數分別為1.91%、3.07%、3.39%、2.83%、3.25%、2.52%、2.55%、2.46%、3.48%。

直觀分析知，以鹽酸小檗堿含量為評價指標，最佳提取工藝條件為A2B3C2，各因素的主次順序為C、B、A。方差分析(表2)表明:A、B因素對鹽酸小檗堿含量無顯著性影響(P＞0.05)，C因素對鹽酸小檗堿含量有顯著性影響(P＜0.05)。綜上，從節約成本和提高效率的角度考慮，確定優選提取工藝為A2B2C2，即10倍量的60%的乙醇提取2次，每次1 h。

表2 鹽酸小檗堿含量方差分析表

2.3 粉萆薢等七味藥水提工藝優選根據單因素考察實驗結果和正交設計實驗結果，確定粉萆薢等七味藥最佳水提取工藝為:8倍量的水提取3次，每次1 h。正交設計實驗中，虎杖苷質量分數分別為0.52、0.66、1.06、0.73、1.28、0.60、1.18、0.55、0.72 mg/g;干膏得率分別為13.09%、16.51%、21.94%、17.60%、23.62%、10.41%、20.38%、16.38%、14.96%;綜合評分［(虎杖苷含量/虎杖苷含量最大值)×0.6+(干膏得率/干膏得率最大值)×0.4)］分別為0.46、0.59、0.87、0.64、1.00、0.45、0.90、0.53、0.59。

2.4 醇沉工藝

2.4.1 正交試驗設計以浸膏的相對密度、醇沉濃度為考察因素，每個因素3水平，將最佳水提工藝的提取液，按下表的因素水平，選用L9(34)正交表安排醇沉實驗，見表3。

表3 因素與水平

2.4.2 提取液的制備按醇提最佳工藝和水提取最佳工藝分別提取黃柏飲片45 g、含粉萆薢的復方飲片540 g，所得提取液平均分為9份(每份相當于飲片65 g)，分別按照因素水平表和正交試驗表所列實驗參數，濃縮至不同程度，冷卻，攪拌下緩慢加入95%乙醇沉至不同濃度，冷處放置24 h，過濾，備用。

2.4.3 干膏得率測定精密量取上述醇沉液5 mL，置干燥恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃烘箱中烘至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻30 min，精密稱定。計算，結果見2.4.4.5項。

2.4.4 虎杖苷測定

2.4.4.1 色譜條件與系統適應性實驗［8］流動相:乙腈-水(23∶77);體積流量:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:306 nm。理論塔板數按虎杖苷峰計算不低于3 000。

2.4.4.2 對照品溶液的制備精密稱取虎杖苷12.74 mg，置25 mL的量瓶中，稀乙醇定容，精密量取1.5 mL置25 mL的量瓶中，稀乙醇定容，搖勻即得(虎杖苷質量濃度0.015 29 mg/mL)。

2.4.4.3 供試品溶液的制備精密量取水提醇沉液1 mL，置25 mL量瓶中，稀乙醇定容，即得。

2.4.4.4 線性關系考察精密吸取虎杖苷對照品溶液3、5、10、15、25、35 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為:Y=3 862.41X+27.463，r=0.999 9，結果表明虎杖苷在進樣量0.045 87～0.535 1 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.4.4.5 測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。計算，虎杖苷質量分數分別為0.94、1.17、0.71、0.89、0.96、0.52、0.86、0.99、0.50 mg/g;干膏得率分別為11.00%、9.80%、8.77%、9.35%、10.20%、8.36%、6.27%、7.07%、6.10%;綜合評分［(虎杖苷含量/虎杖苷含量最大值)×0.6+(干膏得率/干膏得率最大值)×0.4)］分別為0.88、0.97、0.68、0.79、0.86、0.57、0.67、0.76、0.48。

方差分析(見表4):A和B因素對虎杖苷含量和干膏得率均有顯著影響(P＜0.01)，確定最佳工藝為A1B2，即提取液的相對密度為1.05～1.10(60℃)，醇沉質量分數為60%。

表4 方差分析

2.5 驗證實驗按處方比例取粉萆薢、黃柏、景天三七等飲片，共3份，按最佳醇提取工藝提取黃柏:加10倍量60%的乙醇，回流提取2次，每次1 h，測定鹽酸小檗堿量;按最佳水提取工藝提取粉萆薢等七味:加8倍量的水，回流提取3次，每次1 h;水提液的醇沉:浸膏相對密度1.05～1.10(60℃)，加95%乙醇至乙醇質量分數為60%，冷處放置24 h，水提取和醇沉實驗分別測定虎杖苷含量和干膏得率。結果(見表5)表明優選出的工藝穩定可行，重現性好，該提取純化工藝優選條件經中試放大驗證，結果與小試基本吻合，證明為穩定可行的工藝。

表5 驗證實驗結果

3 討論

3.1 粉萆薢等七味水提實驗表明:提取次數對結果有顯著性影響。在篩選出的其它參數不變的情況下，提取3次和4次的虎杖苷質量分數和干膏得率分別為1.27 mg/g、1.28 mg/g;21.51%、22.02%，結果差異不大，故從生產周期和成本角度考慮將提取次數定為3次。

3.2 虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛［8］，虎杖苷是虎杖的有效成分之一［9-10］，具有抵抗內毒素休克、抗病原微生物等作用［11］，與熱痹消的主治功能一致，干膏得率是評價水提取效率和醇沉效率的傳統手段，綜合評分時，兼顧上述兩個關鍵指標，權重系數定位0.6、0.4，具有一定的合理性。

3.3 最佳醇沉工藝所得樣品中虎杖苷的轉移率為92.9%，干膏得率降為原來的52.7%，表明該工藝在最大限度保留和富集有效物質的基礎上盡量去除無效物質，大大降低了服用量。

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