崗梅藥液大孔吸附樹脂精制工藝研究

李潤美， 張 軍， 陳汀波， 陳 威， 陳冠林， 賴小平

(廣州中醫藥大學，廣東廣州510006)

崗梅為冬青科植物梅葉冬青 Ilex asprella(Hook．et Arn．)Champ．ex Benth．的干燥根及根莖［1］，味苦、甘，性涼，功效清熱解毒、生津止渴、利咽消腫、散瘀止痛，臨床用于感冒發熱、肺熱咳嗽、熱病津傷口渴、咽喉腫痛、跌打瘀痛等病癥的治療。藥效學研究表明崗梅有抗流感病毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤作用及抗心肌缺血等作用［2-7］。主要有效成分為皂苷類，ilexoside XXIX是崗梅中含量較大的三萜皂苷類成分。大孔吸附樹脂在分離純化天然產物中有廣泛的應用，AB-8型和D101型大孔吸附樹脂在分離皂苷類成分時具有較大的優勢［8-14］。本試驗以崗梅總皂苷結合ilexoside XXIX為指標優化崗梅藥液精制工藝參數。

1 儀器與試藥

SHIMADZU高效液相色譜儀(日本島津公司)，SEDEX 75蒸發光散射檢測器(法國SEDEX公司)，N2000色譜工作站(浙江大學)，AB204-N型萬分之一電子分析天平，十萬分之一電子分析天平(Sartorius CP225D)。

崗梅采集于廣東省從化森林公園，經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室黃海波教授鑒定為梅葉冬青Ilex asprella(Hook．et Arn．)Champ．ex Benth的根及根莖。對照品ilexoside XXIX純度為98．9%(暨南大學天然藥物研究所張曉琦副教授提供)。乙腈、甲酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2．1 崗梅藥液的提取 取崗梅藥材粗粉905 g，加入8倍量的60%乙醇，加熱回流1．5 h，濾過，濾渣再加入6倍量的60%乙醇，加熱回流1 h，濾過，合并濾液，測定體積，得提取液11 020 mL，備用。

2．2 崗梅總皂苷測定方法

2．2．1 崗梅供試液的制備 量取崗梅藥液適量，蒸干，殘渣用5mL水溶解，上已預處理的AB-8大孔吸附樹脂柱(13 mm×150 mm)，用蒸餾水水洗至澄清，再用95%乙醇洗脫，收集醇洗液至100 mL量瓶刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2．2．2 對照品與測定波長的選擇 在400～700 nm波長處掃描，Ilexoside XXIX與崗梅提取液的紫外吸收曲線基本一致，最大吸收波長為541 nm，故采用ilexoside XXIX標定崗梅總皂苷。Ilexoside XXIX與崗梅提取液的紫外吸收曲線見圖1。

圖1 崗梅提取液和ilexoside XXIX紫外吸收曲線

2．2．3 測定方法 精密吸取供試液0．5 mL，置試管中，水浴蒸干，加5%香草醛冰醋酸溶液0．2 mL和高氯酸0．8 mL，搖勻，在60℃水浴中加熱20 min，取出，冷水冷卻10 min，加冰醋酸至5 mL，搖勻，以相應試劑作空白對照，541 nm處測定吸光度。

2．2．4 崗梅總皂苷標準曲線的制備 精密稱取崗梅對照品ilexoside XXIX 5．43 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得對照品溶液。精密吸取對照品溶液0．02、0．04、0．06、0．08、0．10、0．14、0．18 mL 于試管中，照 2．2．3 項測定總皂苷的含量。以對照品質量濃度C(mg/mL)對吸光度A進行線性回歸，回歸方程為:A=28．383C-0．053，r2=0．999 5，崗梅對照品溶液質量濃度C在4．3～39．1 μg/mL內呈良好的線性關系。

2．3 總皂苷測定方法學考察

2．3．1 精密度實驗 精密吸取0．1 mL ilexoside XXIX對照品溶液于試管中，照2．2．3項測定，重復測定吸光度6次，計算結果得RSD為0．63%，表明儀器精密度良好。

2．3．2 重復性實驗 精密量取崗梅供試液0．5 mL各5份，照2．2．3項下方法測定總皂苷含量，結果得RSD為1．49%，表明方法重現性良好。

2．3．3 穩定性實驗 精密量取崗梅供試液0．5 mL各6份，照2．2．3 項顯色，顯色后室溫放置，分別在0、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h后測定吸收值，實驗結果顯示該方法經過時間的延長，顯色效果不穩定，顯色結束到測定吸收值的時間宜控制在30 min內。

2．3．4 加樣回收率實驗 精密量取崗梅供試液0．5 mL各6份，分別精密加入對照品2．5 mg，水浴蒸干，殘渣加入95%乙醇溶解并定容于50 mL量瓶中，照2．2．3項測定，結果測得回收率為95．92%，RSD為2．14%。

2．4 ilexoside XXIX 測定

2．4．1 色譜條件 經優化色譜條件，確定以 Phenomenex BDS C18柱(250 mm × 4．6 mm，5 μm)為固定相，以乙腈-0．2%甲酸為流動相，按表1梯度洗脫。漂移管溫度:40℃，載氣(氮氣)壓力:2．5 bar，體積流量:1 mL/min，柱溫:28 ℃，進樣量:10 μL。在以上色譜條件下測定，譜圖見圖2，3。

表1 梯度洗脫程序

圖2 ilexoside XXIX HPLC-ELSD圖譜

圖3 崗梅藥液HPLC-ELSD圖譜

2．4．2 ilexoside XXIX標準曲線的制備 分別吸取對照品溶液 1、2、4、10、25、30 μL 注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣質量的自然對數為橫坐標，峰面積的自然對數為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為 Y=1．353 5X+4．749 5，r=0．999 8，表明 ilexoside XXIX 進樣質量在 0．984 ～29．52 μg范圍內的自然對數值與峰面積的自然對數值成良好線性關系。

2．5 ilexoside XXIX測定方法學考察

2．5．1 精密度實驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下，重復注入液相色譜儀6次，測定峰面積，結果RSD為1．02%。表明儀器精密性良好。

2．5．2 重復性實驗 精密量取崗梅藥液50．0 mL各5份，分別水浴蒸干，殘渣加入甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，精密注入高效液相色譜儀各10 μL，測定峰面積，計算ilexoside XXIX的平均含量，RSD為1．14%。表明方法重復性良好。

2．5．3 穩定性實驗 精密量取崗梅藥液50．0 mL各6份，分別水浴蒸干，殘渣加入甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，精密注入高效液相色譜儀各10 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測定峰面積，RSD為1．37%。結果表明供試品溶液在24 h內保持穩定。

2．5．4 加樣回收率實驗 精密量取崗梅藥液10．0 mL各6份，分別精密加入對照品5．0 mg，水浴蒸干，殘渣加入甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，精密注入高效液相色譜儀各10 μL，測定 ilexoside XXIX含量，結果其平均回收率為99．91%，RSD 為 1．21%。

2．6 精制工藝參數的考察與優化

2．6．1 樹脂種類篩選 量取上述崗梅醇提取液61．0 mL(相當于生藥量5 g)3份，水浴蒸干，分別加水溶解至25 mL，上已預處理的AB-8、D101、F型大孔吸附樹脂柱(13 mm×150 mm)，體積流量為1．0 mL/min，收集過柱液;用100 mL蒸餾水洗，收集水洗液，與過柱液合并;再用95%乙醇洗脫，收集醇洗液至100 mL量瓶刻度。將醇洗脫后的樹脂先后用2%NaOH洗至澄清、蒸餾水洗至pH值為7，再用95%乙醇洗至澄清，置于烘箱中，烘干，稱定樹脂質量。精密量取提取液、過柱及水洗液供試液、醇洗液供試液適量，分別按2．2．3項和2．4．1項下進行測定并計算總皂苷和ilexoside XXIX的含量，根據比吸附量及解析率對3種樹脂進行篩選。

比吸附量:A=(M上-M水)/M樹脂;解析率:S=M洗脫/M吸附×100%。式中M上為上柱液中總皂苷或iIlexoside XXIX總含量(g)，M水為過柱液、水洗液中總皂苷或iIlexoside XXIX總含量(g)，M樹脂為樹脂質量(g)，M洗脫為醇洗液中總皂苷或iIlexoside XXIX總含量(g)，M吸附為上柱液中總皂苷或iIlexoside XXIX總含量減去過柱水洗液中總皂苷或iIlexoside XXIX總含量(g)。

實驗結果如表2，AB-8的比吸附量和解析率最高，F型樹脂的比吸附量與解析率均最小。綜合考慮比吸附量與解析率，AB-8大孔吸附樹脂適合用于崗梅總皂苷的精制。

2．6．2 樹脂最大上樣量考察 量取崗梅提取液243．5 mL(相當于生藥量20 g)，減壓回收至無醇味，加水稀釋至100 mL即得上柱液，過已預處理的AB-8大孔吸附樹脂柱(13 mm×150 mm)，按順序收集過柱液，每2．5 mL為1份，共收集34管。將34管過柱及水洗液再分別經AB-8大孔吸附樹脂純化，收集醇洗液，分別按2．2．3項和2．4．1項下進行測定并計算總皂苷和iIlexoside XXIX的濃度。

表2 不同樹脂種類對崗梅動態吸附工藝參數影響

所得動態吸附曲線見圖4，第26管總皂苷質量濃度為0．45 mg/mL，已超過上柱液的5%。而第34管時iIlexoside XXIX未吸附率僅為3．91%，仍未超過上柱液的5%。說明以iIlexoside XXIX作為指標考察樹脂泄漏點有一定的缺陷，不足以全面反映總皂苷的信息，總皂苷對最大上樣量的反應更為敏感，故最大上樣量以總皂苷結果計。樹脂干質量為4．04 g，以5%即得泄漏點計，其最大上樣量為3．09 g生藥/g干樹脂;以總皂苷計，其最大上樣量為119．43 mg總皂苷/g干樹脂。

圖4 崗梅總皂苷的動態吸附曲線

2．6．3 洗脫溶媒濃度考察 按照確定的最大上樣量，將崗梅上柱液過已預處理的AB-8大孔吸附樹脂柱，蒸餾水洗至澄清，再依次以20%、40%、60%、80%、95%乙醇分別洗脫4倍柱體積，收集醇洗液，分別按2．2．3項和2．4．1項下進行測定并計算總皂苷和iIlexoside XXIX的含量。

結果如表3顯示，60%乙醇可累積洗脫下幾乎100%的iIlexoside XXIX和約89%的皂苷，而80%乙醇可累積洗脫下約98．5%的皂苷，接近洗脫完全。綜合考慮工藝成本與洗脫效率，選擇80%乙醇為崗梅的大孔吸附樹脂精制工藝的洗脫溶媒。

表3 不同溶媒質量分數的洗脫吸附結果

2．6．4 洗脫溶媒用量考察 按照確定的最大上樣量及洗脫溶媒濃度，將崗梅上柱液過已預處理的AB-8大孔吸附樹脂柱，蒸餾水洗至澄清，用80%乙醇洗脫，每1倍柱體積分別收集，共收集6倍柱體積，備用。分別按2．2．3項和2．4．1項下進行測定并計算總皂苷和iIlexoside XXIX的含量。

結果見表4顯示，3倍柱體積的80%乙醇能將iIlexoside XXIX洗脫完全，也能洗脫97%的總皂苷，而更多洗脫溶媒僅能增加少量的總皂苷;綜合考慮總皂苷保留率和生產成本，確定洗脫溶媒用量為3倍柱體積。

表4 不同洗脫溶媒用量的洗脫結果

2．6．5 崗梅大孔吸附樹脂精制工藝驗證 根據樹脂精制工藝確定的參數進行重復試驗，取崗梅上柱液適量，平行2份，過已預處理的AB-8大孔吸附樹脂柱(3．5 cm×20．8 cm)，體積流量為1 mL/min，收集過柱液，用蒸餾水洗，洗至澄清，收集水洗液，再用80%乙醇洗脫，收集3倍柱體積，備用。分別按2．2．3項和2．4．1項下進行測定并計算總皂苷和iIlexoside XXIX的含量。結果見表5，6所示，經過AB-8大孔吸附樹脂純化后，總皂苷和iIlexoside XXIX含量保留率均達80%以上，精制后固形物中總皂苷和iIlexoside XXIX分別達到87．03%及 10．83%。

表5 崗梅驗證工藝總皂苷及iIlexoside XXIX測定結果

表6 精制前后固形物中總皂苷及iIlexoside XXIX含量

3 討論

3．1 本實驗以崗梅藥材中特征性成分iIlexoside XXIX標定崗梅總皂苷，以崗梅總皂苷和iIlexoside XXIX保留率為指標，篩選樹脂種類、最大上樣量、洗脫溶媒濃度和洗脫用量等大孔吸附樹脂精制工藝的關鍵參數，并對精制前后HPLC特征圖譜進行比較，結果更為可靠。本實驗還篩選了藥液上柱前的預處理方式，包括離心工藝及上樣濃度對崗梅總皂苷和iIlexoside XXIX保留率的影響。結果顯示上柱液的離心工藝導致總皂苷損失較大，不宜采用;結合生產效率和工藝連續性，將上柱液濃度確定為0．2 g生藥/mL。

3．2 經過實驗研究，確定崗梅藥液的大孔吸附樹脂精制工藝參數為上柱液質量濃度0．2 g生藥/mL，最大上樣量以崗梅總皂苷計為119．43 mg/g干樹脂，以80%乙醇洗脫3倍柱體積。精制后醇洗液可保留80%以上的總皂苷和iIlexoside XXIX，過柱后藥液固形物中總皂苷質量分數為87．0%，iIlexoside XXIX質量分數為10．8%;相應含量提高近1倍。精制前后HPLC-ELSD特征指紋圖譜基本一致，藥效試驗表明崗梅精制物具有抗流感病毒、抗炎效果(結果另文報道)，表明崗梅大孔吸附樹脂精制工藝富集了總皂苷部位，達到富集有效成分的目的。

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