櫻桃李莖段離體培養與快速繁殖技術1)

李海臣,蘭士波,羅旭

(1.黑龍江省大興安嶺地區呼中林業局營林處,呼中 165000;2.黑龍江省林業科學研究所經濟林研究室,哈爾濱 150081;3.黑龍江省林業科學院)

櫻桃李(Prunus cerasiferaEhrh.)是中國珍稀瀕危生物資源和世界寶貴野生果樹資源,果肉柔軟多汁,可溶性固形物含量高,酸味濃,口感風味獨特,具良好食用和保健價值。樹形介于灌木與喬木之間,耐寒力極強[1-2],天然分布在中亞天山、高加索、土庫曼山地、帕米爾阿賴、伊朗、小亞細亞等山區,分布最東端在中國新疆伊犁。

櫻桃李莖段離體培養不受自然周期性和非周期性氣候條件變化的制約,且能保持原始親本的優良性狀和特性,具有獲取遺傳增益的潛力,總而言之,莖段離體培養是規模化、工廠化、快速繁殖苗木的主要方式[3]。筆者以當年萌生的幼嫩莖段為外植體,通過調整細胞分裂素和植物生長調節劑種類和濃度配比,優化離體培養的最適培養基,提出離體培養快速繁殖技術和示范,為徹底拯救、合理保護和創新利用這一珍稀種質提供科技含量高的優質苗木和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 外植體選擇及消毒處理

在黑龍江省林業科學研究所森林培育學重點實驗室、林口縣林業局國家良種繁育基地分別開展離體培養及栽培馴化試驗。莖段離體培養繁殖材料來源于引種栽培的5年植株上當年生幼嫩枝條,清除基部葉片,保留頂部1～2片葉,在洗潔精溶液(水∶洗潔精=1∶500)中清洗,除去表面灰塵。經蒸餾水沖洗后,剪成1.0～2.0 cm莖段,在超凈工作臺上,用0.1%HgCl溶液表面滅菌5～7min,再用無菌水沖洗5～6次,置無菌水中浸泡40～60min。然后,切除與消毒液接觸的傷口部位,吸干材料表面水分。

1.2 培養基制作與培養環境控制

1.2.1 培養基制作。以MS、1/2MS、3/4MS為基本培養基,若無特別說明,其中均附加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L。同時,根據試驗設計要求,在基本培養基中,分別添加不同濃度配比的細胞分裂素(6-BA、KT)和植物生長調節劑(IAA、NAA、2,4-D),并置120 ℃條件下滅菌15 min。

1.2.2 培養環境控制。莖段立體培養對環境條件要求苛刻,在整個培養過程中,將環境條件控制在技術要求范圍內。⑴工莖段腋芽培養:培養溫度25±1.0℃,光照時間16 h/d,光照強度2月日500 lx,pH值5.8;⑵腋芽增殖培養:培養溫度25±1.0℃,光照時間12 h/d,光照強度2000 lx,相對濕度90%,pH值5.8。

1.3 培養基篩選和優化

在無菌條件下,將滅菌莖段接種到添加細胞分裂素和植物生長調節劑種類和濃度配比不同的基本培養基(MS)上離體培養,以優化莖段腋芽萌發和叢芽再生的最適培養基。在離體培養的基礎上,將誘導出的叢生芽單芽的芽尖或分化苗分別轉接到含不同濃度植物生長調節劑的增殖培養基或生根培養基上增殖培養或生根培養,采用L9(34)正交試驗設計和極差分析技術,篩選最適增殖培養基和生根培養基。

1.4 數據統計分析方法

⑴極差分析方法:運用美國北卡納州州立大學研制的SAS(Statistical Analysis System)數據統計分析系統處理相關數據,其中:極差分析采用STAT模塊的ANOVA和GLM完成;

3 結果與分析

3.1 滅菌時間對外植體的影響

在超凈工作臺上,用0.1%HgCl溶液進行外植體表面滅菌5～7min,經無菌水沖洗后,置無菌水中浸泡40～60 min。接種 3 d后,觀察結果(表1)顯示:滅菌不徹底的莖段出現污染及褐化現象,其中:經 0.1%HgCl溶液表面滅菌5 min,外植體污染率及褐化率分別為55%、20%,污染嚴重;經0.1%HgCl溶液表面滅菌6 min、7 min,外植體污染率較低(25%、15%),然而,表面滅菌7 min,外植體切口處褐化程度嚴重,褐化率60%。由此可見,經 0.1%HgCl溶液表面滅菌 6 min效果理想,莖段污染率最低,褐化程度最輕。

表1 滅菌時間對外植體的影響

3.2 外植體腋芽萌發和生長誘導

在無菌條件下,將莖段接種到附加細胞分裂素、植物生長調節劑種類及濃度配比不同的基本培養基上,以誘導腋芽萌發和生長。試驗設計6種腋芽萌發及叢芽再生培養基,分別為:IABA-MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L;IAKT-MS+IAA 0.4mg/L+KT 0.8mg/L;4DBA-MS+2,4-D 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L;4DKT-MS+2,4-D 0.4mg/L+KT 0.8mg/L;NABA-MS+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.8 mg/L;NAKT-MS+NAA 0.4mg/L+KT 0.8 mg/L。試驗結果(表2)表明:植物生長調節劑濃度過低,莖段腋芽生長緩慢;濃度過高促使腋芽徒長,產生試管苗玻璃化現象。培養基內生物調節劑種類及濃度配比直接影響腋芽萌發和生長,接種在附加0.8 mg/L生長素和0.4 mg/L細胞分裂素的基本培養基上,莖段腋芽表現良好,玻璃化程度極輕,其中:附加生長素IAA的效果明顯優于2,4-D和NAA,平均成苗率分別為71%、56%、56%,平均苗高分別為 1.65cm、1.15cm、1.0cm;附加細胞分裂素6-BA的效果較KT理想,平均成苗率分別為66.7%、55.3%,平均苗高分別為1.40cm、1.13cm。綜合考慮細胞分裂素、植物生長調節劑種類和濃度配比,確定MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L+蔗糖30mg/L+瓊脂 7.0mg/L為莖段腋芽萌發和生長的最適培養基。

表2 細胞分裂素、生長調節劑種類和濃度配比對腋芽萌發及生長的效應

3.3 增殖培養基優選及不定芽增殖培養

將叢生芽單芽的芽尖分別接種于MS、1/2MS和3/4MS培養基上,培養中均分別附加3個濃度IAA、6-BA、蔗糖,以及瓊脂6.5 g/L。大量試驗結果說明:基本培養基、生長素、細胞分裂素種類和濃度配比直接影響叢芽增殖,以植物生長素影響效果最大,且6-BA影響效果大于IAA。若細胞分裂素(6-BA)濃度高于1.2 mg/L,即會產生玻璃化現象。采用L9(34)正交試驗設計和極差分析技術(表3)優化選擇增殖培養基,由此可見,6-BA、IAA、基本培養基、蔗糖的極差(R)分別為2.4、2.0、0.68、0.62,對不定芽增殖影響效果由大至小順序:6-BA﹥IAA﹥基本培養基﹥蔗糖。K值由大至小順序:3/4MS﹥MS﹥1/2MS(基本培養基);0.5mg/L﹥0.3mg/L﹥0.7mg/L(IAA);1.0mg/L﹥0.8 mg/L﹥0.6 mg/L(6-BA);30 g/L﹥40g/L﹥20g/L(蔗糖),從而確定3/4MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5mg/L為不定芽最適增殖培養基。

表3 L9(34)正交試驗設計和級差分析結果

3.4 生根培養和練苗移栽

3.4.1 生根培養。以MS、1/2MS為基本培養基,附加0.2 mg/L、0.4mg/L、0.6 mg/L濃度生根調節劑(IBA),設計6種生根培養基。轉接高度適宜的試管苗至生根培養基上,經10 d暗培養后,轉入光下培養。測定結果顯示,基本培養基相同,附加IBA 0.4mg/L生根效果最佳,幼根數量及平均根長分別為8條/株(1/2MS)、6 條/株和 6.0 cm(1/2MS)、5.7 cm(MS);IBA濃度相同,植入1/2MS培養基,生根效果明顯優于MS培養基,確定 1/2MS+IBA 1.4mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7 mg/L為最適生根培養基。

3.4.2 練苗移栽。在自然光條件下,掀開培養瓶的薄膜蓋,培養15 d后,取出發育良好的生根苗,洗凈根上附著的培養基,植入經0.5%KMnO4消毒的混合基質(河沙∶有機土∶腐熟雞糞=1∶3∶1)中,澆透水,噴施多菌靈消毒,并加強光照,改善通風條件,翌年春季移入種質資源保存圃。

4 結論

4.1 櫻桃李離體培養所需外植體必經嚴格消毒滅菌,且滅菌時間直接影響培養效果,以0.1%HgCl溶液表面滅菌6 min最理想,莖段污染率最低,褐化程度最輕。

4.2 在基本培養基(MS)中附加適當濃度細胞分裂素和植物生長調節劑質可有效誘導莖段離體再生,提高再生效率。櫻桃李莖段腋芽萌發最適培養基為MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L,植入此培養基,莖段腋芽誘導率最高。

4.3 基本培養基、植物生長素和細胞分裂素種類及濃度配比直接影響叢芽增殖,植物生長素影響效果顯著,且6-BA影響效果大于IAA,通過正交試驗和極差分析,篩選出叢芽最適培養基,即:3/4MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30mg/L+瓊脂6.5g/L。

4.4 在基本培養基內附加 IBA,生根效果最佳,且IBA濃度相同,植入1/2MS培養基,生根效果明顯優于MS培養基,確定1/2MS+IBA1.4mg/L+瓊脂 7g/L+蔗糖30mg/L。

[1] 俞德浚.中國果樹分類學[M].北京:農業出版社,1979:58-60.

[2] 張加延,周恩.中國果樹志(李卷)[M].北京:中國林業出版社,1998:1-5.

[3] 陳正華.木本植物組織培養及應用[M].北京:高等教育出版社,1986:303-310.

[4] 劉崇琪.新疆野生櫻桃李離體再生及其資源評價[D].泰安:山東農業大學,2008:5-17.

[5] 蘭士波,田新華,李紅艷.歐洲甜櫻桃的組織培養與快速繁殖技術[J].中國園藝文摘,2010(10):27-28.