ELISA測(cè)定疫苗中慶大霉素含量的結(jié)果評(píng)價(jià)分析

劉少剛 吳潔

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 廣東汕頭 515041）

在現(xiàn)有疫苗的生產(chǎn)過程中常加入慶大霉素等抗生素。抗生素類藥物對(duì)感染性疾病有重大的治療作用，然而濫用抗生素會(huì)產(chǎn)生無法挽回的不良后果。中國(guó)和美國(guó)等國(guó)家都制定了生物制品中抗生素的最大殘留限量指標(biāo)，以嚴(yán)格控制在生物制品生產(chǎn)中加入抗生素的量[1]。

常用的檢測(cè)疫苗中抗生素含量的方法有微生物學(xué)方法、理化方法和免疫分析方法[2]。而間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒測(cè)定法具有操作時(shí)間短、特異性好、速度快、操作誤差小等特點(diǎn)[3]，以至于得到了廣泛的應(yīng)用。本文采用酶標(biāo)試劑盒間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，并將乙型腦炎減毒活疫苗進(jìn)行10倍稀釋來測(cè)定乙型腦炎減毒活疫苗中慶大霉素的含量。通過以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照物，測(cè)定了疫苗制品中殘留抗生素的含量，以建立疫苗中抗生素含量檢測(cè)的有效方法，通過控制疫苗中抗生素的含量，來提高疫苗使用的安全性。

1 材料與樣品

1.1 試劑與儀器

慶大霉素ELISA快速檢測(cè)試劑盒(北京望爾生物技術(shù)有限公司)。硫酸慶大霉素注射液(批號(hào)09062027，天津藥業(yè)焦作有限公司)；酶標(biāo)儀(Mode l550，美國(guó)BIO-RAD)；洗板機(jī)；微量加樣器；電熱恒溫水浴鍋；振蕩器；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)200814，含量638U/mg，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。疫苗穩(wěn)定劑由廣東省汕頭市生物制品研究所疫苗室提供。

表1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及測(cè)定結(jié)果

表2 慶大霉素在乙型腦炎減毒活疫苗中的回收率

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2 疫苗

乙腦減毒活疫苗和未含慶大霉素的乙腦減毒活疫苗購(gòu)自廣東省汕頭市生物制品股份有限公司。

1.3 樣品

1人份規(guī)格的乙型腦炎減毒活疫苗12批，5人份規(guī)格的乙型腦炎減毒活疫苗12批，均由北京天壇生物制品股份有限公司提供；生產(chǎn)原材料、原液、輔料及半成品由成都生物制品研究所生產(chǎn)管理部提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取適量慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，加未含慶大霉素的乙腦減毒活疫苗10倍稀釋液[4～6]配制成使慶大霉素含量分別為0.1、0.15、0.5、1.5、5、40ng/mL，即得一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。參考王靜[7]等的對(duì)數(shù)直線方程法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度A450測(cè)定值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-0.4354X-0.5431(R2=0.9974)。結(jié)果表明，慶大霉素在0.1～8ng/mL范圍內(nèi)樣本吸光值與慶大霉素含量呈良好的負(fù)相關(guān)關(guān)系（表1和圖1）。

2.3 慶大霉素在乙型腦炎減毒活疫苗中的回收率

采用ELISA試劑盒的檢測(cè)方法對(duì)慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行加樣回收率的檢測(cè)。精密稱取含已知慶大霉素含量的乙型腦炎減毒活疫苗10倍稀釋液的同一份樣品9份，分成3組，3組分別加入0.5、1.0、5ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)慶大霉素溶液各1.0mL，得低中高3種濃度的樣品溶液。按ELISA試劑盒的檢測(cè)方法測(cè)定樣品溶液。計(jì)算慶大霉素在乙型腦炎減毒活疫苗中的平均回收率為96.27%，RSD為2.3%。說明此方法的回收率較好。可用于檢測(cè)乙型腦炎減毒活疫苗中的慶大霉素(表2）。

表3 日內(nèi)精密度的測(cè)定

表4 日間精密度的測(cè)定

表5 12批乙型腦炎減毒活疫苗中慶大霉素的含量

2.4 慶大霉素在乙型腦炎減毒活疫苗中的精密度檢測(cè)

取含標(biāo)準(zhǔn)慶大霉素含量為0.15、1.5、5ng/mL的低中高3種濃度的乙型腦炎減毒活疫苗的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行吸光度的測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日間精密度。通過測(cè)定和計(jì)算得到日內(nèi)精密度的RSD為2.92%(n=3)，表明此方法的日內(nèi)精密性良好。日間精密度的RSD為2.46%(n=3)，表明此方法的日間精密性良好,結(jié)果見表3和表4。

2.5 乙型腦炎減毒活疫苗中慶大霉素含量的測(cè)定

將12批1人份規(guī)格的和5人份規(guī)格的乙型腦炎減毒活疫苗進(jìn)行10倍稀釋，并按上述方法測(cè)定乙型腦炎減毒活疫苗中慶大霉素的含量。測(cè)得1人份規(guī)格的12批乙型腦炎減毒活疫苗的測(cè)定范圍為10.11～14.6ng/mL，平均值為12.32ng/mL；5人份規(guī)格的12批乙型腦炎減毒活疫苗的測(cè)定范圍為3.08～6.14ng/mL，4.87ng/mL。結(jié)果見表5，RSD均＜10%，說明同一劑量不同批號(hào)間的乙型腦炎減毒活疫苗所含有的慶大霉素量比較穩(wěn)定，各個(gè)批次間差異較小，用于疫苗中抗生素含量的測(cè)定，其適用性較好(表5）。

3 討論

抗生素殘留量的檢測(cè)常用3種方法[8]：微生物學(xué)方法、免疫分析方法和理化方法。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)法特異性差，易被非抗生素抑菌劑所影響；而免疫分析方法具有操作時(shí)間短、特異性好、速度快、操作誤差小等特點(diǎn)，以至于得到了廣泛的應(yīng)用。在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)過程中加入了多種物質(zhì)，成分復(fù)雜，不僅有病毒液，還加入了穩(wěn)定劑，這些成份有可能對(duì)抗生素含量的測(cè)定存在干擾。文獻(xiàn)報(bào)道[9～10]慶大霉素采用試劑盒的方法其檢測(cè)限度可達(dá)到0.1ng/mL，但在使用試劑盒檢測(cè)時(shí)，疫苗穩(wěn)定劑明顯干擾慶大霉素的測(cè)定。然而通過使疫苗稀釋的辦法可減小其測(cè)定的干擾。因此本文通過采用ELISA試劑盒并稀釋疫苗的方法對(duì)抗生素進(jìn)行檢測(cè)，使疫苗中各成分得到稀釋以減少其含量測(cè)定的干擾[10～11]。通過此方法所得的回收率較高(96.27%，RSD為2.3%)，線性良好(0.1～8ng/mL，R2=0.9974)，試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間精密度的RSD也均＜10%，精密性好。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了1人份規(guī)格和5人份規(guī)格的乙型腦炎減毒活疫苗各12批，測(cè)得慶大霉素含量的平均值分別為12.32ng/mL(RSD=2.35%)和4.87ng/mL(RSD=1.82%)，表明同一劑量不同批號(hào)間乙型腦炎減毒活疫苗所含的慶大霉素量變化不大。

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