三七膠囊含量測定方法的改進

何選林， 王群英

(湖南省永州市藥品檢驗所，湖南永州425100)

三七膠囊由三七細粉制成的膠囊，具有散瘀止血，消腫定痛，用于咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛，跌撲腫痛，原發(fā)性血小板減少性紫癜［1］。三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、Re、Rb1是三七的主要活性成分［2］。關于三七膠囊的含量測定只測定人參皂苷Rg1［3］。本試驗采用高效液相色譜法同時測定三七膠囊中三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量［4-8］，為該產品質量控制提供方法依據和參考。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜系統(tǒng)1525泵，2996紫外檢測器(美國)，Empowers工作站。三七皂苷R1對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110745-200415)，人參皂苷Rg1對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110703-200726)，人參皂苷Re對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110754-200822)，人參皂苷Rb1對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110704-200921)，三七膠囊樣品(規(guī)格0.3 g/粒，A 公司生產批號為090301、090501、100201、3 批產品);乙腈為色譜純、重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水為流動相，按表 1 進行梯度洗脫，檢測波長為203 nm;柱溫:室溫，進樣量:10 μL［9-11］。

在該色譜條件下，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1的保留時間分別為 32.8 min、36.5 min、37.2 min、61.5 min，理論塔板數分別為 1.2 ×105、1.2×105、1.5 ×105、5.0 ×105，人參皂苷 Rg1與 Re分離度為1.9，見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution

2.2 對照品溶液貯備液和對照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1;人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品分別為 5.32 mg、20.10 mg、5.42 mg、20.11 mg 置25 mL量瓶中，用甲醇適量振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。再精密吸取貯備液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品0.6 g，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超聲30 min，放冷后，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 取溶劑作為陰性對照溶液。

2.5 線性關系考察 精密量取混合對照品貯備液1，2，3，5，10 mL 溶液分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，求回歸方程，三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的回歸方程和相關系數分別為:Y=165.8+259 122.1X，r=0.999 96;Y=1 804.7+1 441 035.6X，r=0.999 92;Y=147.1+218 035.3X，r=0.999 90;Y=685.16+842 120.8X，r=0.999 96，結果表明，當進樣量為10 μL時，三七皂苷 R1、人參皂苷 Re在 20～200 μg/mL，人參皂苷 Rg1、Rb1在80 ～800 μg/mL 濃度范圍內，呈良好的線性關系。

2.6 精密度考察 取2.2項下的溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄連續(xù)5次的峰面積，三七皂苷R1:RSD=0.60%;人參皂苷Rg1:RSD=0.35%;人參皂苷 Re:RSD=0.95%;人參皂苷 Rb1:RSD=0.77%。

2.7 重復性試驗 取2.11項下同一份樣品測定5次，含三七皂苷R1為0.81%(RSD=1.06%);人參皂苷Rg1為3.27%(RSD=1.18%);人參皂苷 Re為1.07%(RSD=1.48%);人參皂苷Rb1為3.10%(RSD=0.80%);結果表明重復性好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同份樣品分別在0、4、8、12、16 h測定三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，含三七皂苷R1為0.80%(RSD=1.10%);人參皂苷Rg1為3.29%(RSD=1.15%);人參皂苷Re為1.06%(RSD=1.38%);人參皂苷Rb1為3.15%(RSD=0.84%);結果表明穩(wěn)定性好。

2.9 陰性對照試驗 取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液按本文條件進樣為10 μL，色譜圖見圖1，在本文條件下陰性對照無干擾。

圖1 高效液相色譜Fig.1 HPLC chromatograms

2.10 回收率試驗 精密取已知含量的同一批樣品6份，分別精密加入三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品適量，按樣品測定項下制備供回收用的溶液，依法測定即得回收率，結果見表2。

2.11 含量測定 分別吸取2.3項下供試品溶液與2.2項下對照品溶液各10 μL，照2.1項的色譜條件，記錄色譜圖見A、B，按外標法以峰面積計算，含量結果見表3。

表2 加樣回收率測定結果Tab.2 Results of recovery test

表3 樣品的含量測定結果(n=3)Tab.3 Result of sample determination(n=3)

3 討論

3.1 三七膠囊由三七純中藥制成，但三七成分復雜未知，本實驗選取的梯度系統(tǒng)，能夠滿足系統(tǒng)適應性并保證各成分分離的重現性，可對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1同時準確定量，能有效地監(jiān)控三七膠囊的內在質量。

3.2 在處理樣品時，曾參考《中國藥典》三七的含量測定的處理方法，但從實驗結果發(fā)現，三七中4種成分的含量偏低，本試驗樣品直接用甲醇超聲處理，樣品中4種指標成分HPLC達到基線分離。

［1］新藥轉正標準第22冊［S］.2002:646.

［2］王 雁，畢開順.三七HPLC指紋圖譜的建立［J］.中國中藥雜志，2003，28(4):316-320.

［3］國家中成藥標準匯編內科氣血津液分冊［S］.2002:19.

［4］中國藥典［S］.一部.2010:11.

［5］馮 中，李曉燕，劉 波，等.HPLC測定不同廠家復方丹參片中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量［J］.中成藥，2009，31(1):71-74.

［6］柯金虎，孫玉琴，馬 妮，等.HPLC法測定三七保肝膠囊中皂苷的含量［J］.中國科技雜志，2004，(3):40-42.

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［10］王 強，江英橋，馬世平，等.高效液相色譜法測定三七中三七皂苷 R1的含量［J］.中國中藥雜志，2000，25(10):617.

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