DPP Ⅳ基因影響卵巢癌細胞生物學行為的機制探討

王忠民 盧永科

（1 大連婦產醫院婦二科，遼寧 大連 116033；2 大連醫科大學毒理學研究所，遼寧 大連 116021）

卵巢腫瘤是女性生殖器常見的腫瘤之一，其中惡性卵巢癌約占10%，居女性生殖器惡性腫瘤的第3位，而上皮性卵巢癌是婦產科惡性腫瘤中主要的死亡原因。卵巢癌患者一方面由于卵巢的盆腔解剖特點，加之目前缺乏特異性的診斷方法，造成了早期發現的困難性，所以卵巢癌在臨床經常是潛行的，在確診時已近晚期。發生遠處轉移的晚期病例雖然通過提高手術技巧可以做到最大程度的腫瘤細胞減滅術同時結合包括鉑類、紫杉醇類以及眾多二線化療藥物在內的綜合治療手段，但是卵巢癌患者的5年生存率仍然很低[1]。卵巢癌發生轉移的主要方式是直接種植播散、淋巴結和血行轉移。如能抑制和治療卵巢癌的遠處轉移對提高5年生存率是有意義的。隨著分子生物學和腫瘤基礎研究的飛躍發展，使人們認識到腫瘤最終是一種基因病。基于此認識人們可以從分子和基因水平探索卵巢癌的病因和發病機制并尋找卵巢癌的診斷和治療方法。人類DPP Ⅳ基因定位于2q24，約90kb，含26個外顯子。它編碼766個氨基酸的多肽鏈，相對分子質量約110×103的跨膜糖蛋白[2]。隨著研究的深入，發現DPP Ⅳ基因在腫瘤進展中起重要作用[3,4]，但是其具體作用機制研究比較少。我們此次探討DPP Ⅳ基因抑制卵巢癌細胞系惡性行為的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞系：HO-8910PM卵巢癌細胞系是來自于人類卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌，購于中科院典型培養物保藏委員會細胞庫；將真核表達載體PcDAN3.1（+）和全長野生型DPP Ⅳ基因通過陽離子脂質體轉染HO-8910PM卵巢癌細胞系，分別命名為HOPcDAN和HODPP Ⅳ細胞。HODPP Ⅳ細胞高表達DPP Ⅳ基因，以上細胞轉染及建立均由本實驗室完成。HO-8910PM細胞系培養于RPMI 1640培養液中，其中含10%FCS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。HOPcDAN和HODPPⅣ細胞培養于上述培養液，另外還加入400μg/mLG418維持壓力篩選。3種細胞均置于37℃的5%濃度CO2孵育箱中培養。

侵襲小室（Mill cell Chamber）購于BD公司。

1.2 試劑

碘化丙啶（PI）購于北京岳泰生物公司；吖啶橙購于上海聚源生物科技有限公司；G418購于Invitrogen公司；凋亡DNA梯形檢測試劑盒（TACS Apoptotic DNA Laddering Kit，Trevigen，Inc）；兔抗人Bcl-2和Fas單克隆購于Sigma公司；人工基質膠（Matrigel）購于北京大學醫學院病理學教研室。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞（FCM）法測定不同卵巢癌細胞系的凋亡率及細胞周期

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ細胞分別取5×104個制備成單細胞懸液，經PBS漂洗兩次后離心，100目篩網過濾離心。加入PI工作液0.5mL（工作濃度10μg/mL），室溫避光放置30min后，利用流式細胞儀檢測。檢測前以標準熒光微球調整儀器的變異系數，使其穩定在2%范圍內。檢測時收集2×104個細胞，熒光強度以對數級放大，光散射數據存盤。數據利用Macintosh 650計算機上的Modifit軟件分析。利用設門的方法（橫坐標前向角，縱坐標側向角）將壞死細胞框除，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.3.2 吖啶橙染色觀察細胞凋亡現象

3種細胞分別取5×104個制備成單細胞懸液，經PBS漂洗兩次后離心，100目篩網過濾離心。蓋玻片放置于6孔培養板中，分別加入3種經過上述方法處理的細胞懸液，置于37℃，5%CO2培養箱中培養24h，使HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ細胞爬行于玻片后，PBS液漂洗3次，每次3min。吸凈PBS液后將配制好的吖啶橙溶液滴于蓋玻片上，直接反轉，放于潔凈蓋玻片上，熒光顯微鏡觀察，攝片。

1.3.3 DNA Ladder 測定

實驗方法嚴格按TACS Apoptotic DNA Laddering Kit操作說明進行。

1.3.4 透射電鏡觀察

透射電鏡標本制作參考文獻[5]。

1.3.5 Wester blot 檢測Fas/Bcl-2基因表達

具體操作參考文獻[6]。采用TAKARA公司提供的Image Master ED Elite V3.01分析軟件對Wester blot圖像進行光密度掃描，計算DDP IV/β-actin比值，用以比較各細胞DDP IV基因蛋白表達水平差異。

1.3.6 不同卵巢癌細胞增殖

取HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ卵巢癌細胞，以8000個細胞/200μL/孔 分別接種于96孔培養板，同時與試驗孔平行設不加細胞只加培養液的空白對照孔，從接種后第24h開始每種細胞每天取6孔，采用MTT法檢測細胞活性。選492nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度（absorbance A492值），取6孔平均值記錄結果，以時間為橫軸，A492值為縱軸繪制細胞生長曲線，連續測定7d。

1.3.7 細胞體外黏附試驗

具體操作參考文獻[7]。

1.3.8 體外細胞侵襲測定

細胞侵襲性測定使用Matrigel侵襲小室，具體操作參考文獻[8]。

1.3.9 體外細胞趨化能力測定

方法步驟與體外侵襲力測定相同，只是侵襲小室的濾膜不用人工基質膠覆蓋。

1.4 統計學分析

每個細胞結果均重復6次。計數資料以百分比表示，計量資料以表示。利用SPSS10.0統計軟件包進行統計分析。計量資料多樣本均數間的兩兩比較采用單向方差分析（One-way ANOVA），計數資料多樣本間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 不同細胞系的凋亡率及細胞周期

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ細胞在細胞周期G1期前均出現亞二倍體凋亡峰。但是HODPP Ⅳ細胞的凋亡峰更明顯。HODPPⅣ細胞凋亡率顯著高于HO-8910PM、HOPcDNA細胞（P＜0.05）；HO-8910PM和HOPcDNA細胞凋亡率比較無顯著性差異（P＞0.05）。具體數值見表1和圖1。

表1 3種細胞的凋亡率及細胞周期的變化（%）

2.2 吖啶橙染色細胞凋亡形態

HO-8910PM和HOPcDNA細胞未發生凋亡時細胞核為均勻黃色或黃綠色熒光，核內RNA為紅色，細胞質為桔紅色或紅色；當HODPPⅣ細胞發生凋亡時，細胞膜包裹部分細胞質和部分細胞核組成成分從細胞上分離，形成典型的凋亡小體。或細胞膜僅包裹部分細胞質從細胞上分離，形成不典型的凋亡小體。見圖2、圖3。

2.3 細胞凋亡的DNA梯形圖

HO-8910PM和HOPcDNA細胞未發生凋亡時電泳后無梯形條帶出現，HODPP Ⅳ細胞發生凋亡時電泳后可出現明顯的梯形條帶，見圖4。

2.4 透射電鏡觀察凋亡形態

圖1 3種細胞亞二倍凋亡峰及細胞周期變化

圖2 熒光顯微鏡下HO-8910PM、HOPcDNA細胞未發生凋亡（10×40）

圖3 熒光顯微鏡下HODPP Ⅳ細胞發生凋亡（10×40）

圖4 HO-8910PM、HOPcDNA和HODPPⅣ細胞DNA梯形圖檢測

圖5 透射電鏡下HO-8910PM、HOPcDNA細胞未發生凋亡（上）及HODPP Ⅳ細胞發生凋亡的形態（下）（×6000）

在透射電鏡可見：當HODPP Ⅳ細胞發生凋亡時，細胞體積變小，細胞漿濃縮，線粒體輕度腫脹，細胞漿內見空泡增多；細胞膜保存完整，細胞膜表面微絨毛和偽足減少或消失；細胞膜出現出芽、出泡現象。細胞核濃縮和邊集甚至發生破碎（圖5）。

2.5 Fas/Bcl-2基因蛋白表達水平

HODPP Ⅳ細胞Fas基因蛋白表達水平明顯高于HOPcDNA和HO-8910PM細胞（P＜0.05）；HOPcDNA細胞和HO-8910PM細胞比較無差異（P＞0.05）。HO-8910PM和HOPcDNA細胞Bcl-2基因蛋白表達水平明顯高于HODPP Ⅳ細胞（P＜0.05）；HO-8910PM和HOPcDNA細胞比較無差異（P＞0.05）。見圖6、圖7。

圖6 Wester blot檢測Fas基因表達水平

圖7 Wester blot檢測Bcl-2基因表達水平

2.6 細胞增殖曲線

所有細胞在前4d均處于緩慢的增殖狀態，4d后3種細胞才開始進入相對較快的增殖狀態。HO-8910PM和HOPcDNA細胞增殖速度比較無顯著性差異（P＞0.05）；而HODPP Ⅳ細胞在7d內的增殖速度始終低于HO-8910PM和HOPcDNA細胞，統計分析有顯著性差異（P＜0.01），見圖8。

圖8 不同細胞系增殖曲線

2.7 體外細胞侵襲性測定

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP IV細胞侵襲到膜下和侵襲小室下室的平均細胞數分別為（138.67±3.06）、（136.00±3.61）和（61.33±3.06）。HO-8910PM與HOPcDNA細胞系比較無顯著性差異（P=0.912）；HODPP Ⅳ細胞顯著低于HO-8910PM和HOPcDNA細胞（P＜0.001）。

2.8 體外細胞移動性測定

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ細胞系侵襲到膜下和侵襲小室下室的平均細胞數分別為（204.67±2.89）、（208.00±9.64）和（125.67±6.43）。HO-8910PM和HOPcDNA細胞系比較無顯著性差異（P=0.944）； HODPP Ⅳ細胞顯著低于HO-8910PM和HOPcDNA細胞（P=0.001；P=0.002）。

2.9 不同細胞系的黏附試驗

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP IV細胞系黏附細胞數分別為（144.33±4.73）、（140.67±3.22）和（72.33±3.22）。HO-8910PM和HOPcDNA細胞系比較無顯著性差異（P=0.28）； HODPP IV細胞顯著低于HO-8910PM和HOPcDNA細胞（P＜0.001）。

3 討 論

細胞表面表達的DPP Ⅳ基因最初作為T細胞激活分子，目前認為是免疫系統細胞激活的普遍標志物。DPP Ⅳ組織分布比較廣泛，但是在不同組織之間表達差別很大。在一些腫瘤細胞DPP Ⅳ的高表達與腫瘤細胞的侵襲力呈正相關性[2,9-12]。我們在前期工作中也得出相同結論[13]。為了研究DPP Ⅳ基因的高表達對高轉移能力的卵巢癌細胞系生物行為的影響，我們利用陽離子脂質體轉染法將人類全長野生型DPP Ⅳ基因轉染到人類卵巢癌細胞系HO-8910PM細胞中，經G418壓力篩選后克隆出1株高表達DPP Ⅳ基因的卵巢癌細胞系命名為HODPPⅣ，用于卵巢癌細胞中DPP IV基因功能的研究。結果顯示，在體外的研究中發現轉染了DPP Ⅳ基因的HODPP Ⅳ細胞與母系HO-8910PM、HOPcDNA細胞系比較，其細胞增殖能力、黏附性、移動性和侵襲性顯著降低。研究表明DPP Ⅳ基因的高表達和其蛋白產物的高活性有抑制腫瘤細胞惡性表型的作用。

細胞凋亡（apoptosis）又稱細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。由于它在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵角色，對個體的正常發育及細胞凋亡紊亂在病理學研究中的重要作用，引起了人們對其機制和組分的廣泛而深入地研究。實驗過程中我們發現一種很有趣的現象，光鏡下母系HO-8910PM細胞和HOPcDNA細胞大多數細胞為不規則多邊形，細胞呈鋪石狀排列，核大、深染，核仁清晰，染色質顆粒粗，核分裂相易見；而HODPPⅣ細胞呈現圓形和橢圓形，細胞核明顯縮小，大部分細胞相互接觸，呈現較為緊密排列狀生長，且細胞增殖、侵襲和轉移能力明顯降低。為了研究此現象發生的原因，本研究嘗試應用了多種方法從不同層面探討細胞凋亡是否在其中起作用。結果顯示轉染了DPP Ⅳ基因并高表達DPP Ⅳ基因的HODPP Ⅳ細胞在細胞各個不同增殖期均出現了明顯的凋亡現象；同時在高表達DPP Ⅳ基因的HODPP Ⅳ細胞中凋亡促進基因Fas高表達，而凋亡抑制基因Bcl-2卻明顯低表達。國外學者[4]在研究中也發現了類似現象。本研究結果提示凋亡機制是DPP Ⅳ基因抑制高轉移潛能卵巢癌細胞系HO-8910PM惡性行為的機制之一。

綜上所述，DPP Ⅳ基因在各種良、惡性腫瘤中具有很多生物學功能。由于DPP Ⅳ基因與腫瘤的相關性是在近年才被關注，因此相關的研究資料有限，在這里尚無法完全的剖析和解釋其在惡性腫瘤的發生、發展和侵襲轉移的分子生物學機制。目前國際上許多學者正致力于研究DPP Ⅳ基因的表達水平及其酶的活性在各種組織環境中的不同生理學作用。雖然DPP Ⅳ基因是一個有用的診斷和預后的指標，但是目前尚未有關將誘導或抑制DPP Ⅳ基因表達作為治療手段的報道，但是隨著DPP Ⅳ基因在惡性腫瘤轉化和侵襲轉移機制中生物學作用的逐漸明確，有望在準確地理解DPP Ⅳ基因生物學特性的基礎上，找到治療惡性腫瘤的新的途徑和方法。

[1] Weide R,Arndt M,Pandorf A,et al.Ovarian cancer treatment reality in northern Rheinland-Pfalz (Germany).Suboptimal surgical treatment as a possible cause for inferior survival[J].Onkologie,2007,30(12)： 611-617.

[2] Havre PA,Abe M,Urasaki Y,et al.The role of CD26/dipeptidyl peptidase IV in cancer[J].Front Biosci,2008,13： 1634-1645.

[3] Ghersi G,Zhao Q,Salamone M,et al.The protease complex consisting of dipeptidyl peptidase IV and seprase plays a role in the migration and invasion of human endothelial cells in collagenous matrices[J].Cancer Res,2006,66(9)： 4652-4661.

[4] Yu DM,Wang XM,McCaughan GW,et al.Extraenzymatic functions of the dipeptidyl peptidase IV-related proteins DP8 and DP9 in cell adhesion,migration and apoptosis[J].FEBS J,2006,273(11)：2447-2460.

[5] 蔡文琴.現代實用細胞與分子生物學實驗技術[M].北京：人民軍醫出版社,2003：222-230.

[6] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis.T著.金冬雁,黎孟楓,侯云譯.分子克隆實驗指南[M].2 版.北京：科學出版社,1992：768-798.

[7] Ghersi G,Dong H,Goldstein LA,et al.Regulation of fibroblast migration on collagenous matrix by a cell surface peptidase complex[J].J Biol Chem,2002,277(32)： 29231-29241.

[8] Kajiyama H,Kikkawa F,Suzuki T,et al.Prolonged survival and decreased invasive activity attributable to dipeptidyl peptidaseⅣ over expression in ovarian carcinoma[J].Cancer Research,2002,62(10)： 2753-2757.

[9] O?óg J,Jarz?b M,Pawlaczek A,et al.Expression of DPP4 gene in papillary thyroid carcinoma[J].Endokrynol Pol,2006,57(Suppl A)：12-17.

[10] Masur K,Schwartz F,Entschladen F,et al.DPPIV inhibitors extend GLP-2 mediated tumour promoting effects on intestinal cancer cells[J].Regul Pept,2006,137(3)： 147-155.

[11] Roesch A,Wittschier S,Becker B,et al.Loss of dipeptidyl peptidase IV immunostaining discriminates malignant melanomas from deep penetrating nevi[J].Mod Pathol,2006,19(10)： 1378-1385.

[12] Taniguchi K,Takano T,Miyauchi A,et al.Differentiation of follicular thyroid adenoma from carcinoma by means of gene expression profiling with adapter-tagged competitive polymerase chain reaction[J].Oncology,2005,69(5)： 428-435.

[13] 王忠民,盧永科,韓瑩等.不同惡性行為卵巢癌細胞系CD26/DPP IV基因的表達[J].中國醫學科學院學報,2005,27(2)： 205-210.